牙周膜相关蛋白-1（PLAP-1）对Wistar大鼠颅骨缺损修复效能的影响

发布时间：2020-10-15 04:39

　　 背景和目的： 牙周膜又称牙周韧带(periodontal ligament,PDL)是一种环绕牙根,并连接牙根和牙槽骨的致密结缔组织。牙周膜细胞(periodontal ligament cells,PDLCs)具有成骨样细胞特性,可以分化为成骨细胞和成牙骨质细胞。但正常生理状态下,牙周膜为坚韧和富有弹性的组织,终生不发生骨质化。体外研究发现,牙周膜相关蛋白-1(periodontal ligament-associated protein-1, PLAP-1)与牙周组织这种保持自身稳定的动态平衡有密切关系。PLAP-1是通过研究人牙周膜中活性基因表达谱系而发现并定义的。在牙周组织的分化和矿化过程中,PLAP-1与其他生长因子之间保持一种负反馈调节的平衡,防止牙周组织过度骨质化；并且,在骨关节炎等疾病的发病机制中,PLAP-1也是作为一个负性调节因子,抑制软骨的形成。 骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)具有多向分化潜能,根据不同的诱导条件,该细胞可分化为各种不同的细胞。研究发现,将骨髓基质干细胞与牙周成纤维细胞共培养一段时间后,BMSCs可具有牙周成纤维细胞的特性。且BMSCs取材简便,增殖能力强,所以完全可以替代牙周膜成纤维细胞成为研究牙周组织再生的种子细胞。 大鼠颅骨临界骨缺损模型是骨组织工程中评价骨修复效果的经典模型,大部分哺乳动物的颅、颌面骨在形态学和胚胎起源上相似,即颅骨与颌骨均为单一的膜性化骨(下颌骨、蝶骨大翼除外)；在解剖结构上,颅骨与下颌骨均为由2层皮质骨内夹松质骨构成；在生理的角度上,颅骨的皮质骨和萎缩的下颌骨相似。所以,该模型是理想的下颌骨缺损模型替代者。 鉴于目前对PLAP-1的研究只局限于体外,本实验首次尝试构建超表达PLAP-1的大鼠BMSCs,通过免疫细胞化学技术和实时荧光定量PCR (Real-time quantitative PCR,qPCR)技术鉴定并检测成骨标志基因的变化,随后将其移植入Wistar大鼠颅骨标准缺损处,八周后观察PLAP-1对颅骨修复效能的影响,以期为进一步研究其在牙周组织的稳定和牙周炎中的作用提供一定的理论基础。 材料和方法： 1、超表达PLAP-1影响大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞方向分化的实验研究 采用脂质体法将逆转录病毒表达载体pBABE-hygro-PLAP-1,转入293T病毒包装细胞,用含有PLAP-1病毒的培养液感染大鼠骨髓基质干细胞,采用潮霉素B(Hygromycin B)筛选获得稳定超表达PLAP-1的大鼠骨髓基质细胞。采用细胞免疫化学的方法和实时荧光定量PCR技术检测PLAP-1蛋白和PLAP-1mRNA在大鼠骨髓基质干细胞中的表达情况,并进一步检测各个成骨相关基因的表达情况,以正常大鼠骨髓基质干细胞和感染逆转录病毒空载体的大鼠骨髓基质干细胞作对照。 2、PLAP-1对VVistar大鼠颅骨缺损修复效能的影响 采用牛Ⅰ型胶原制备胶原载体,培养细胞,并把胶原载体和细胞共培养,制备大鼠颅骨缺损极限骨缺损模型,把胶原载体-细胞复合物移植入动物颅骨缺损处,于8周时取材,通过标本大体观察、X线检查、软硬组织切片,HE染色,免疫组织化学染色,Masson染色,Kossa染色等方法,观察骨修复的效果。 结果： 1、超表达PLAP-1抑制大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞方向分化的实验研究经Hygromycin B筛选成功获得稳定超表达PLAP-1的BMSCs, RT-qPCR和免疫细胞化学结果证实,转染pBABE-hygro-PLAP-1后的BMSCs在mRNA和蛋白水平均有PLAP-1的表达,而转染空载体和正常BMSCs中PLAP-1mRNA和蛋白的表达均为阴性。实时荧光定量PCR显示各相关成骨基因表达量降低。 2、PLAP-1对Wistar大鼠颅骨缺损修复效能的影响 经标本大体观察、X线检查、石蜡切片和硬组织切片HE染色,免疫组织化学染色,Masson染色,Kossa染色等方法观察测定,以超表达PLAP-1的大鼠骨髓基质干细胞做种子细胞的实验组大鼠颅骨的修复效果要差与空白载体组,以及正常细胞组的修复效果。 结论： 1、超表达PLAP-1可以使大鼠骨髓基质干细胞中的各相关成骨标志基因的表达量降低。 2、超表达PLAP-1可抑制Wistar大鼠颅骨缺损的骨修复效果。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2012
【中图分类】：R782.2
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
英文缩略词中英文对照
前言
第一部分 超表达PLAP-1影响大鼠骨髓基质干细胞向成骨方向分化
    材料与方法
    结果
    附图
    讨论
第二部分 PLAP-1对Wistar大鼠颅骨缺损修复效能的影响
    材料与方法
    结果
    附图
    讨论
参考文献
致谢
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本文编号：2841706