人p27kiplcDNA克隆及其对人舌癌细胞系Tca8113细胞生物学作用的研究

发布时间：2020-10-17 23:31

　　 目的：舌鳞状细胞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一，它生长快，浸润强，早期常有淋巴结转移，治疗效果不够理想。近年来，随着分子生物学的快速发展，基因治疗在肿瘤治疗中表现出不可估量的作用。 本实验以体外培养的人舌鳞状细胞癌细胞Tca8113为研究对象。将克隆的人p27kip1基因连接到pcDNA3载体上，通过脂质体介导转染Tca8113细胞。探讨其对人舌癌细胞系Tca8113细胞的生物学作用。 方法：从正常肝组织中，提取组织中的总RNA。应用RT-PCR将RNA逆转录为cDNA。参照Gene Bank中人p27kip1 cDNA序列，设计2个引物，应用PCR扩增p27kip1 cDNA。将PCR产物行TA克隆进行测序。测序后选择真核表达载体pcDNA3构建重组表达质粒。将pcDNA3-p27kip1和pcDNA3质粒DNA分别用脂质体包裹转染培养细胞，而后通过G418培养液进行筛选，应用PCR法鉴定p27kip1基因转染的Tca8113细胞株。采用流式细胞术检测p27kip1蛋白的表达；凋亡相关蛋白Bcl-2的表达；细胞周期及细胞凋亡。用MTT法检测p27kip1基因转染对Tca8113细胞生长的影响；检测化疗药物对p27kip1基因转染的Tca8113细胞生长的影响。 结果： 1.经测序我们所获得的p27kip1cDNA与Gene Bank登录的序列一致为具有完整阅读框架的p27kip1基因。成功地构建了pcDNA3-p27kip1重组表达质粒，pcDNA3-p27kip1重组表达质粒经酶切鉴定正确。筛选出了抗G418阳性细胞克隆，建立二个新的细胞株。分别命名为：转染质粒pcDNA3-p27kip1的细胞株为Tca-P27；转染空载体pcDNA3的细胞株为Tca-P3。应用PCR鉴定，pcDNA3-p27kip1质粒转染的Tca8113细胞基因组DNA出现p27kip1cDNA扩增带，Tca8113细胞和转染空载体pcDNA3的Tca-P3细胞基因组DNA的PCR产物为阴性。证明了pcDNA3-p27kip1质粒成功地转染入Tca8113细胞。 2.流式细胞术检测p27kip1蛋白的表达结果以p27kip1蛋白表达的阳性细胞百分数表示。Tca-P27细胞p27kip1蛋白表达的阳性细胞百分数明显高于Tca-P3、Tca8113细胞，差异显著（P0.05）。Tca8113与Tca-P3细胞p27kip1蛋白阳性细胞百分数无显著性差异（P0.05）。显示转染p27kip1基因的 WP=91 Tca8113细胞获得了p27kip1蛋白的高表达。 3.MTT法检测Tca8113细胞、Tca-P3细胞、Tca-P27细胞24h(小时)、48h、72h、96h OD值，以OD值代表细胞相对数量，结果Tca-P27细胞增殖速度明显低于Tca8113细胞和Tca-P3细胞。24h、48h，Tca-P27细胞比Tca8113、Tca-P3细胞增殖速度慢，72h、96h时，Tca-P27细胞出现增殖下降。而Tca8113、Tca-P3细胞在24h、48h、72h、96h呈持续增殖状态，三者增殖速度差异显著（P0.05）。显示转染p27kip1基因后抑制了Tca8113细胞生长。 4.流式细胞术检测细胞周期 结果Tca-P27细胞G0/G1期占细胞百分数明显高于Tca-P3和Tca8113细胞G0/G1期细胞百分数，显著差异（P0.05）。Tca-P27细胞出现了G0/G1期阻滞。表明转染外源性p27kip1基因在Tca8113细胞中的高表达抑制了细胞周期向S期过渡，使细胞阻滞于G0/G1期，抑制了细胞的增殖。 G2/M和S期所占细胞百分数Tca-P27细胞明显低于Tca8113细胞和Tca-P3细胞所占的细胞百分数（P0.05）。通过计算细胞的增殖指数，Tca-P27细胞增殖指数明显低于Tca-P3细胞和Tca8113细胞的增殖指数。三者增殖指数比较差异显著（P0.05）。显示了转染外源性p27kip1基因，使Tca8113细胞出现G0/G1期阻滞，细胞增殖下降，抑制了细胞生长。 5.流式细胞术检测凋亡结果 在G1期前Tca-P27细胞出现了凋亡峰，表明Tca-P27细胞出现了凋亡。Tca8113细胞没有明显凋亡峰出现；Tca-P3细胞也没有明显凋亡峰出现，Tca-P27细胞凋亡指数明显高于Tca8113细胞和Tca-P3细胞的凋亡指数，差异显著（P0.05）。显示了转染p27kip1基因由于p27kip1基因的高表达，诱导了Tca8113细胞出现了凋亡。 6.流式细胞术检测Bcl-2蛋白的表达结果以Bcl-2蛋白表达阳性细胞百分数表示，Tca-P27细胞阳性细胞百分数明显低于Tca8113细胞和Tca-P3细胞阳性细胞百分数，差异显著（P0.05）。Tca8113细胞与Tca-P3细胞阳性细胞百分数比较无显著差异（P.05）。显示了转染p27kip1基因由于p27kip1基因的高表达，引起了凋亡相关蛋白Bcl-2的表达的下调。Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，推测转染外源p27kip1基因诱导了Tca8113细胞的凋亡，可能与Bcl-2蛋白表达下调有关。 7.用MTT法对8种化疗药作用Tca-P27细胞、Tca-P3细胞、Tca8113细胞，24h、48h测OD值计算化疗药对三组细胞的生长抑制率。结果顺铂、丝裂霉素、氟尿嘧啶对三组细胞都有明显的抑制作用。平阳 霉素对三组细胞有一定的抑制作用，但以上化疗药对三组细胞的抑制率比较无显著差异（P0.05）均未显示出转染p27kip1基因有提高以上化疗药对Tca8113细胞的生长抑制作用。环磷酰胺、甲氨蝶呤、阿霉素对三组细胞无明显抑制作用。长春新碱对Tca-P27细胞抑制率明显高于Tca8113细胞和Tca-P3细胞，差异显著（P0.05）。随时间的增加，细胞抑制率增高（P0.05）。显示出转染p27kip1基因提高了长春新碱对Tca8113细胞的生长抑制作用。长春新碱使 WP=92 转染外源p27kip1基因的Tca8113细胞抑制率增加，推测可能因长春新碱作用于M期及其干扰细胞肌醇磷脂代谢而影响细胞增殖。同
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R739.8
【部分图文】：

第三章 实验结果27kip1 重组质粒的构建野生型 p27kip1 基因的扩增及序列测定野生型 p27 kip1 基因扩增提取的组织中总 RNA 作逆转录模板，将 RNA 逆转录为 cDNA。以 cDNA 为PCR 扩增人 p27kip1cDNA，扩增产物经电泳见一约 600bp 的片段，同时以 比较特异性片段长度。如图 1 第 1、2、3 泳道为 PCR 产物，约 600bp 片段，道为分子量标准对照。1 2 3 4

图 2 TA 重组质粒酶切电泳图第 1 泳道为标尺 λDNA HindⅢ+EcoRI 第 2、3 泳道 p27kip粒（EcoR1+XhoI）酶切片段 第 4、5 泳道为 p27kip1TA 克隆重组6 泳道 DL-2000 Marker经酶切鉴定正确，提取人 p27kip1cDNA 重组质粒进行测序，Gene Bank 登录的序列一致，证明我们所获得的 p27kip1cDNA 为具的 p27kip1 基因，结果如图 3、4

人的p27kip1cDNA测序图
【参考文献】

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本文编号：2845452