组蛋白去甲基化酶Jmjd3对TNF-α诱导外源性成骨细胞凋亡的作用机制研究

发布时间：2020-10-19 14:10

　　 目的:慢性根尖周炎(Chronic apical periodontitis,CAP)作为口腔颌面部最常见的疾病之一,其病理过程主要是炎症诱导的根尖周牙槽骨组织破坏,是导致牙齿丧失的主要原因。慢性根尖周炎不仅会引起根尖周骨组织破坏、牙齿丧失,还与一些全身性、系统性疾病的发生和预后有关。诱导成骨细胞介导的骨组织形成,进而修复缺损的根尖周骨组织,是慢性根尖周病损的治疗目标。在真核生物的细胞核中,核心组蛋白与其外包绕的DNA构成染色质的基本单位-核小体。组蛋白的N末端可以发生磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等多种修饰,继而对染色质结构以及转录过程产生影响,从而维持基因转录程序、决定细胞命运和特性。其中,组蛋白H3第27位赖氨酸残基三甲基化(Trimethylation of histone H3 lysine 27,H3K27me3)与基因转录抑制相关。具有十字形结构域蛋白3(Jumonji domain-containing 3,Jmjd3),别名为赖氨酸特异性去甲基化酶6B(Lysine-specific demethylase6B,KDM6B),是目前已鉴定的作用于组蛋白H3第27位赖氨酸残基(Histone H3 lysine 27,H3K27)位点的组蛋白去甲基化酶之一。Jmjd3能够催化H3K27me3发生去甲基化,从而使基因转录由抑制变为激活状态。近年来,Jmjd3调控的表观遗传修饰在调节骨代谢方面的作用受到关注。在线粒体途径的成骨细胞内源性凋亡过程中,Jmjd3通过调节抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2(B cell lymyphoma-2,Bcl-2)的表达及促凋亡蛋白与B细胞淋巴瘤-2相互作用的细胞死亡介质(Bcl-2 interacting mediator of cell death,Bim)的磷酸化,抑制成骨细胞凋亡进程。但Jmjd3是否参与到肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)诱导的成骨细胞外源性凋亡过程中,以及其具体调控的机制,尚未见报道。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)既可以通过激活半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶8(cysteine aspartic acid specific protease8,caspase8),发生级联裂解反应活化凋亡蛋白caspase3,最终导致细胞凋亡出现,也可以通过抑制肿瘤坏死因子受体相关因子2(TNF receptor associated factors 2,TRAF2)干扰细胞程序性死亡,从而激活核转录因子(Nuclear factor kappaB,NF-κB)和c-JUN氨基末端激酶(c-JUN N-terminal kinase,JNK)信号通路,促进细胞增殖。当TNF-α联合放线菌酮(Cycloheximide,CHX)共同作用于细胞后,CHX能够抑制促进细胞增殖的信号通路,并通过死亡受体通路诱导细胞凋亡的发生。Ras相关结构域家族(Ras association domain family,RASSF),由RASSF1-RASSF10十个成员组成,均包括特色的Ras相关结构域(Ras-association domain,RA),参与调节细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、细胞迁移和黏附,以及微管稳定性等,对肿瘤的形成有着至关重要的作用。其中,RASSF5,也被称为Ras效应因子1(Novel Ras effector 1,NORE1),是RASSF家族中唯一具有RA和SARAH(Sav/Rassf/Hippo)结构域的成员。RASSF5通过促进肿瘤抑制基因p53和p21的活化,阻断细胞RNA和蛋白质合成的G1期,从而使细胞生长停滞。大量研究表明,RASSF5是死亡受体介导的外源性凋亡通路中重要的促凋亡基因。前期实验结果显示,在TNF-α和CHX诱导的外源性成骨细胞凋亡的过程中,RASSF5与Jmjd3表达有一定的相关性,因此,我们推测RASSF5可能是Jmjd3一个潜在的靶基因,两者是否具有靶向作用,RASSF5是否参与TNF-α诱导的成骨细胞凋亡的调控,并且在外源性凋亡的过程中发挥何种作用,尚未见报道。综上所述,本研究旨在以小鼠成骨细胞MC3T3-E1为研究对象,以TNF-α为干预因素,以组蛋白去甲基化酶Jmjd3及其下游RASSF5为研究靶点,探讨Jmjd3在TNF-α诱导的外源性成骨细胞凋亡中的表达及作用,以期为慢性根尖周炎的骨缺损治疗提供新的靶点。研究方法:一、实验方法1、培养小鼠成骨细胞MC3T3-E1使用α-MEM培养基进行细胞培养,该培养基中含有10%胎牛血清、1×10~5U/L青霉素及1×10~5 U/L链霉素,并将细胞放置于5%CO_2、37℃、饱和湿度的培养箱内培养。以20 ng/mL TNF-α联合1μg/mL CHX为刺激因素,诱导MC3T3-E1细胞凋亡。2、采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetra zolium bromide,MTT)方法检测0、10、20、40 ng/mL TNF-α联合1μg/mL CHX作用于MC3T3-E1细胞24 h,对其细胞活力的影响;Annexin V-别藻蓝素(Allophycocyanin,APC)/碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色后,流式细胞术检测0、20、40 ng/mL TNF-α联合1μg/mL CHX作用于MC3T3-E1细胞24 h,对其凋亡率的影响。3、采用实时聚合酶链反应(Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)和蛋白印迹(Western blot)方法检测20 ng/mL TNF-α联合1μg/mL CHX作用于MC3T3-E1细胞0、2、4、8 h后,Jmjd3的mRNA水平和蛋白水平变化。4、采用Annexin V-APC/PI染色后,流式细胞术法检测10μM GSK-J4(组蛋白去甲基化酶Jmjd3活性抑制剂)预处理2 h,20 ng/mL TNF-α联合1μg/mL CHX作用于MC3T3-E1细胞24 h,对其凋亡率的影响;采用Western blot检测10μM GSK-J4预处理2 h,20 ng/mL TNF-α联合1μg/mL CHX作用于MC3T3-E1细胞0、4、8 h,细胞凋亡相关蛋白聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase,PARP)的裂解水平。5、靶向Jmjd3的shRNA转染MC3T3-E1细胞,建立Jmjd3低表达的细胞系(shJmjd3),非特异性转染用于阴性对照(shCont)。采用流式细胞术检测转染效率,Real-time PCR和Western blot检测在shJmjd3组和shCont组细胞中,Jmjd3 mRNA和蛋白的表达水平。6、采用Annexin V-APC/PI染色后,流式细胞术法检测20 ng/mL TNF-α联合1μg/mL CHX作用于shCont组和shJmjd3组细胞24 h,对其凋亡率的影响;采用倒置显微镜观察,经20 ng/mL TNF-α联合1μg/mL CHX作用于shCont组和shJmjd3组细胞24 h,细胞形态的变化;采用caspase3活性检测的方法检测20 ng/mL TNF-α联合1μg/mL CHX作用于shCont组和shJmjd3组细胞6 h,对caspase3活性的影响;采用Western blot的方法检测20 ng/mL TNF-α联合1μg/mL CHX作用于shCont组和shJmjd3组细胞0、2、4、6、12、24 h后,PARP的裂解水平。7、采用Real-time PCR的方法检测20 ng/mL TNF-α联合1μg/mL CHX作用于shCont和shJmjd3细胞0、2、4 h后,Jmjd3和RASSF5 mRNA水平的变化;采用染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)的方法检测20 ng/mL TNF-α联合1μg/mL CHX作用于shCont和shJmjd3细胞2 h后,RASSF5启动子区H3K27me3 mRNA相对表达量的变化。二、统计方法每组实验至少重复3次,实验结果以均数±标准差(Standard Deviation,SD)表示。采用SPSS l7.0软件建立数据库,单因素方差分析以及Dunnett t检验进行统计学分析,双侧P0.05为差异有统计学意义。结果:一、TNF-α诱导成骨细胞凋亡,且与其浓度呈正相关1、分别采用0、10、20、40 ng/mL TNF-α联合1μg/mL CHX作用于MC3T3-E1细胞24 h,通过MTT法检测发现,随着TNF-α浓度的升高,细胞活力逐渐降低;2、分别采用0、20、40 ng/mL TNF-α联合1μg/mL CHX作用于MC3T3-E1细胞24 h,采用Annexin V-APC/PI染色后,流式细胞术检测细胞凋亡率发现,随着TNF-α浓度的升高,细胞凋亡的比率逐渐增加。结合上述实验结果,后续实验选择20 ng/mL TNF-α联合1μg/mL CHX作为刺激因素诱导MC3T3-E1细胞凋亡。二、Jmjd3在TNF-α诱导的成骨细胞凋亡过程中表达增加采用20 ng/mL TNF-α联合1μg/mL CHX作用于MC3T3-E1细胞0、2、4、8 h,分别采用Real-time PCR、Western blot检测Jmjd3 mRNA、蛋白的表达量发现,在凋亡发生的过程中,Jmjd3的表达量增加。三、抑制Jmjd3活性,降低TNF-α诱导成骨细胞凋亡比率1、采用10μM GSK-J4预处理MC3T3-E1细胞2 h,20 ng/mL TNF-α联合1μg/mL CHX作用24 h后,Annexin V-APC/PI染色,流式细胞术检测细胞凋亡率发现,经GSK-J4预处理组与TNF-α联合CHX处理组相比较,MC3T3-E1细胞凋亡率降低,GSK-J4处理组与空白对照组相比较,凋亡率无明显差异;2、采用10μM GSK-J4预处理MC3T3-E1细胞2 h,20 ng/mL TNF-α联合1μg/mL CHX作用0、4、8 h后,Western blot检测PARP裂解水平发现,经GSK-J4预处理组细胞PARP裂解水平降低。四、沉默Jmjd3,抑制TNF-α诱导成骨细胞的凋亡1、流式细胞术检测靶向Jmjd3的shRNA转染MC3T3-E1细胞的转染效率,shCont和shJmjd3组细胞转染效率均在80%以上;Real-time PCR、Western blot检测Jmjd3在shCont和shJmjd3细胞中mRNA和蛋白的表达水平,与shCont组相比较,Jmjd3在shJmjd3组细胞中mRNA的表达水平降低,蛋白的表达量降低;2、采用20 ng/mL TNF-α联合1μg/mL CHX作用于稳定转染的shCont和shJmjd3细胞24 h,Annexin V-APC/PI染色,流式细胞术检测细胞凋亡率,与shCont组相比较,shJmjd3组细胞的凋亡率降低;3、采用20 ng/mL TNF-α联合1μg/mL CHX作用于稳定转染的shCont和shJmjd3细胞24 h,倒置显微镜下观察细胞形态变化发现,与shCont组相比较,shJmjd3组凋亡细胞的数量降低;4、采用20 ng/mL TNF-α联合1μg/mL CHX作用于稳定转染的shCont和shJmjd3细胞6 h,caspase3活性试剂盒染色后,荧光显微镜下观察发现,与shCont组相比较,shJmjd3组细胞caspase3活性较低;5、采用20 ng/mL TNF-α联合1μg/mL CHX作用于稳定转染的shCont和shJmjd3细胞0、2、4、6、12、24 h,Western blot检测PARP裂解水平发现,与shCont组相比较,shJmjd3组细胞PARP裂解水平降低。五、Jmjd3通过调节RASSF5启动子区域H3K27me3的募集水平调控RASSF5的表达1、采用20 ng/mL TNF-α联合1μg/mL CHX作用于稳定转染的shCont和shJmjd3细胞0、2、4 h,Real-time PCR检测Jmjd3和RASSF5的mRNA相对表达量发现,两者表达趋势一致,与shCont组相比较,shJmjd3组细胞表达RASSF5水平降低;2、采用20 ng/mL TNF-α联合1μg/mL CHX作用于稳定转染的shCont和shJmjd3细胞2 h,ChIP结果表明,与shCont组相比较,shJmjd3组细胞RASSF5启动子-750/-581和-235/-70区域H3K27me3的水平明显增高,-550/-373区域H3K27me3的水平无明显差异。结论:1、抑制Jmjd3活性及沉默Jmjd3后,成骨细胞凋亡比率降低,说明Jmjd3促进TNF-α诱导的外源性成骨细胞凋亡的发生;2、沉默Jmjd3降低促凋亡基因RASSF5的表达,增加其启动子区域H3K27me3的表达,说明Jmjd3可能通过调控RASSF5启动子区域去甲基化水平调控RASSF5的表达,从而调控TNF-α诱导的外源性成骨细胞凋亡过程。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R781.341
【部分图文】：

中国医科大学博士学位论文3 实验结果NF-α诱导成骨细胞凋亡，且与其浓度呈正相关TT 实验结果表明，10 ng/mL TNF-α对细胞活力的影响不明显，随着 T增加，达到 20 ng/mL 以上时，细胞活力明显降低（图 1A）。流式细胞，20 ng/mL、40 ng/mL TNF-α能够诱导 MC3T3-E1 细胞凋亡，且随着 T增加凋亡比率增加（图 1B）。

中国医科大学博士学位论文凋亡比率，其中 Annexin V-APC+/PI-、Annexin V-APC+/PI+记 ng/mL TNF-α组相比较。 Jmjd3 在 TNF-α诱导的成骨细胞凋亡过程中表Real-time PCR 结果表明，20 ng/mL TNF-α联合 1 μg/ 0、2、4、8 h 后，Jmjd3 表达量增加，并且在 2 htern blot 结果表明，20 ng/mL TNF-α联合 1 μg/mL CHX4、8 h 后，Jmjd3 蛋白表达量增加（图 2B）。

非特异性转染用于阴性对照（shCont），流式细胞术确认 MC3T3-E1 细胞转染效率（图4A）；Real-time PCR（图 4B）和 Western blot（图 4C）明确 Jmjd3 mRNA 和蛋白水平的低表达；流式细胞术（图 4D）和显微镜下细胞形态观察（图 4E）结果均表明，在 20 ng/mL TNF-α联合 1 μg/mL CHX 作用下，与 shCont 组相比较，shJmjd3组细胞凋亡比率降低；caspase3 活性检测结果表明，20 ng/mL TNF-α联合 1 μg/mLCHX 作用 6 h，与 shCont 组相比较， shJmjd3 组细胞活化的 caspase3 含量明显降低（图 4F）；Western blot 结果显示，20 ng/mL TNF-α和 1 μg/mL CHX 作用 0、2、4、6、12、24 h 后
【参考文献】

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本文编号：2847314