PLGA支架上HGFs整合素α5β1力学信号传导机制的初步研究

发布时间：2020-10-26 05:13

　　 目的:1.探讨静压力对聚乳酸-乙醇酸聚合物(PLGA)支架上人牙龈成纤维细胞(HGFs)中整合素α5β1、黏着班激酶(FAK)、磷酸化FAK(p-FAK)及Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)表达的影响;2.探讨抑制HGFs中整合素α5β1的表达后,FAK、p-FAK和COL-Ⅰ表达的变化情况,以初步探讨整合素α5β1在HGFs的机械力学信号传导和纤维化过程中的作用机制。方法:1、采用组织块培养法进行HGFs的原代培养;取第4-6代的HGFs接种于PLGA支架上,构建HGFs的三维培养模型。2、采用重物加载模型,对PLGA-HGFs复合体施加25g/cm2的静压力,作用时间分别为0、3、6、12、24、48小时。采用RT-qPCR和Western blot技术检测三维培养的HGFs整合素α5β1、FAK、p-FAK和COL-Ⅰ的mRNA与蛋白表达变化情况。3、利用整合素α5β1抑制剂(ATN-161)构建HGFs的整合素α5β1抑制模型。采用CCK-8技术检测不同浓度(0、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM、1mM)的ATN-161对细胞增殖活性的影响,作用时间分别是0、24、48、72小时;采用RT-qPCR技术检测不同浓度(0、10nM、100nM、1μM、10μM)的ATN-161对HGFs表达整合素α5β1 mRNA的影响情况,作用时间为48小时。4、对PLGA-HGFs复合体加入浓度为1μM的ATN-161,作用时间分别为0、3、6、12、24、48小时;对PLGA-HGFs复合体加入浓度为1μM的ATN-161后,施加25g/cm2的静压力,作用时间分别为0、3、6、12、24、48小时,采用RT-qPCR和Western blot技术检测三维培养的HGFs整合素α5β1、FAK、p-FAK和COL-Ⅰ的mRNA与蛋白表达变化情况。结果:1、采用组织块培养法成功培养出原代细胞,经传代纯化细胞,性状稳定,取第4-6代HGFs接种于PLGA支架,构建PLGA-HGFs三维培养模型。2、对PLGA支架上HGFs施加25 g/cm2的静压力后,HGFs整合素α5β1、FAK(p-FAK)和COL-Ⅰ的mRNA和蛋白表达量均上调。整合素α5β1、FAK的mRNA和蛋白表达量在3-6h时表达量最高,6h后缓慢下降;磷酸化FAK蛋白表达量在12h时表达量达到峰值,12h后逐渐下降,趋于正常值;COL-Ⅰ的mRNA和蛋白表达量均升高,在24h时表达量最高,24h后缓慢下降。与整合素α5β1、FAK相比,COL-Ⅰ的变化反应较慢。3、在72h内,浓度低于或等于10μM时,ATN-161对HGFs增殖活性无明显影响。浓度高于10μM后,ATN-161对HGFs增殖活性有明显影响,随着时间,抑制作用逐渐增强。浓度为1μM的ATN-161对整合素α5β1的抑制作用最为显著。4、在加入浓度为1μM的ATN-161实验组中,HGFs的整合素α5β1、FAK(p-FAK)、COL-ⅠmRNA和蛋白表达量均有下降。在PLGA-HGFs复合体中加入浓度为1μM的ATN-161后,静压力作用下HGFs的整合素α5β1、FAK、COL-ⅠmRNA表达量在3h时稍有升高,3h后均降低,且低于对照组;整合素α5β1、FAK、COL-Ⅰ的蛋白水平总体上也均有降低;COL-Ⅰ的蛋白表达量在3-6h时有显著的升高,6h后逐渐下降。结论:1、本研究成功构建了PLGA-HGFs三维培养及力学加载模型。2、静压力可以促进HGFs整合素α5β1、FAK(p-FAK)和COL-ⅠmRNA与蛋白的表达,整合素α5β1和FAK参与HGFs力学信号转导。3、静压力作用下,整合素α5β1感应力学信号,调控下游FAK的表达和磷酸化水平,影响细胞合成COL-Ⅰ,从而参与细胞外基质的纤维化过程。
【学位单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R783.5
【部分图文】：

图 1-1 细胞加力模型图Fig1-1 The modified “weight” method for loading compressive forceA HGFs 的原代培养 ×40 B HGFs 的传代培养 ×40图 1-2 HGFs 培养Fig1-2 The culture of human gingival fibroblasts

HGFs培养

图2-1 A：静压力对HGFs表达整合素α5 mRNA的影响；B：静压力对HGFs表达整合素β1 mRNA的影响；C：静压力对 HGFs 表达 FAK mRNA 的影响；D：静压力对 HGFs 表达 COL-Ⅰ mRNA 的影响Fig2-1 A: The mRNAexpression of Integrinα5 under compressive force; B:The mRNA expressionof Integrinβ1under compressive force; C:The mRNA expression of FAK under compressiveforce; D: The mRNA expression of COL-Ⅰ under compressive force注：*表示不同加力时间组与未加力组之间比较 P＜0.05。结果显示：对 PLGA 支架上 HGFs 施加 25g/cm2的静压力后，与未加力组相比，整合素 α5 的 mRNA 表达量在 12 小时内均显示上调，在 6 小时的表达量最高，差异有统计学意义（P＜0.05)；在加力 6 小时之后，整合素 α5 的 mRNA 表达量逐渐恢复至未加力（0 小时）组水平。与未加力组相比，整合素 β1 的 mRNA 表达量在 48 小时内均
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本文编号：2856545