miR-504通过靶向负调控CDK6抑制口腔癌细胞增殖机制的探讨

发布时间：2020-10-26 18:55

　　 目的:明确miR-504对口腔癌细胞Tca-8113中细胞生物学行为的影响,包括细胞增殖、迁移、侵袭、平板克隆和凋亡,进行下游靶基因的筛选和验证。探讨miR-504在Tca-8113生物学行为中所发挥的作用与相关调节机制,为深入理解口腔癌发病分子机制和寻找新的分子靶向治疗靶点奠定理论基础。方法:(1)本实验通过转染人工合成的miR-504模拟物和无关序列NC来调节miR-504在口腔癌细胞Tca-8113中表达水平,进而研究miR-504在口腔癌细胞Tca-8113中所起的作用。通过RT-qPCR检测miR-504在口腔癌细胞Tca-8113中表达水平的差异。以转染无关序列NC的Tca-8113细胞作为对照。(2)上调miR-504在口腔癌细胞Tca-8113中的表达水平,通过口腔癌细胞的增殖能力、迁移能力、侵袭能力、平板克隆能力以及细胞凋亡来评价miR-504的作用。(3)通过在线microRNA靶基因预测工具(miRanda,Target Scan和miRTarBase)预测miR-504的靶基因,双荧光素酶实验进行验证,Western blotting对靶基因进行检测。(4)通过Western blotting和RT-qPCR对miR-504抑制口腔癌细胞Tca-8113增殖机制进行初步探讨。结果:(1)RT-qPCR检测miR-504的表达,结果表明转染miR-504模拟物后,与NC组相比miR-504的表达水平显著提高(P0.01)。(2)上调口腔癌细胞miR-504的表达水平后,与NC组相比细胞增殖能力、细胞迁移能力、细胞侵袭能力、细胞平板克隆能力显著被抑制,细胞凋亡能力无显著性差异。(3)生物信息学技术预测miR-504的靶基因,最终选定CDK6为靶基因进行后续实验。(4)双荧光报告基因显示转染miR-504后构建的荧光报告基因载体Wt CDK6-3'UTR活性明显降低。(5)Western Blotting结果显示:转染miR-504后,CDK6蛋白表达量明显下调。(6)E2F1、Cyclin D1和Beclin 1在miR-504过表达组较阴性对照组蛋白表达量明显下调,p21在miR-504过表达组较阴性对照组蛋白表达量明显上调。结论:本研究以口腔癌中miR-504的异常表达为切入点,探讨miR-504在口腔癌中的作用以及调节机制,miR-504高表达抑制口腔癌细胞体外增殖、迁移、侵袭和平板克隆能力,在口腔癌细胞中可能扮演着抑癌角色,明确了miR-504与CDK6的靶向调节关系,可为临床治疗口腔癌提供一种新的思路及理论依据。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.8
【部分图文】：

注：与对照组比较*p<0.05，**p<0.01。图2.1 瞬时转染miR-504 mimics后Tca-8113细胞miR-504 mRNA 表达变化2.2 miR-504-5p 可抑制口腔癌细胞增殖表 2.1 调节 miR-504 表达水平对 Tca8113 细胞活力的影响Groups oh 24h 48h 72hControl 0.512±0.060 1.071±0.111 1.924±0.073#2.795±0.041##10nM miR-504 Mimicsgroup0.512±0.060 0.766±0.063 1.216±0.065**##1.894±0.094**##50nM miR-504 Mimicsgroup0.512±0.060 0.594±0.022 1.088±0.081**##1.597±0.107**##100nM miR-504 Mimicsgroup0.512±0.060 0.598±0.008 0.999±0.007**##1.543±0.017**##NC 0.512±0.060 0.790±0.041 1.748±0.094* 2.715±0.156注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与 NC 组比较，#P<0.05，##P<0.01。

实验结果显示，miR-504 mimics 作用于细胞后，细胞生别是处理 48h 和 72h。与对照组相比，miR-504 mimic（P<0.01），说明上调 miR-504 表达可抑制细胞增殖，降1 和图 2.2。2 可以看出，100nM miR-504 Mimics group 转染 48h 后定这一条件进行后续实验。表 2.2 调节 miR-504 表达水平对 Tca8113 细胞增殖率的影响ps 24h 增殖率 48h 增殖率 Mimics group 71.52%±12.30% 63.20%±12.50% 6 Mimics group 55.46%±8.20% 56.55%±14.10% 5 Mimics group 55.84%±6.80% 51.92%±6.70% 73.76%±10.10% 90.85%±15.40% 9

山西医科大学硕士学位论文表 2.3 调节 miR-504 表达水平对 Tca8113 细胞迁移的影响组别 细胞数 相对倍数 迁移率CON 73.00 10.88 /NC 65.80 8.33 0.90 0.11 90%MI 20.00 3.35**##0.27 0.05 27%注：MI 组与 CON 组相比，**P<0.01；MI 组与 NC 组相比，##P<0.01；NC 组与 CON 组相比，无差异。
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本文编号：2857389