米诺环素对侵入成骨细胞内金黄色葡萄球菌作用的实验研究

发布时间：2020-11-02 23:18

　　 细菌感染引起的牙周炎和种植周围炎是临床上较为难治愈的疾病，这可能与某些细菌可以进入宿主细胞，逃避了体液免疫反应以及抗菌药物(不能进入细胞的药物)有关。金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus，SA)是引起感染性疾病的常见致病菌，有文献报道，SA可以侵入到成骨细胞内或被吞噬细胞吞噬，引起感染的经久不愈和反复发作。治疗的关键在于选择一种可以进入成骨细胞内且不影响其功能的抗菌药物，我们前期实验研究证实米诺环素(minocycline，MINO)可以进入成骨细胞内，但在细胞内是否能发挥抗菌作用仍无相关报道，本实验将对此问题进行研究，初步了解MINO的细胞内抗菌作用，有助于金黄色葡萄球菌细胞内感染治疗的合理化用药，为刘洪臣提出的人工种植牙给药的假设奠定实验基础。 本实验首先通过体外培养获得大量的成年大鼠牙槽骨成骨细胞(maturerat alveolar osteoblast，MRAOBs)，然后观察不同浓度的米诺环素对MRAOBs增殖、蛋白合成以及碱性磷酸酶活性的影响，以确定米诺环素在成骨细胞内抗菌实验中较适合的参考浓度，并将其作用于被金黄色葡萄球菌感染的成骨细胞，观察其对体外培养的成骨细胞内外细菌的抗菌作用。结果表明米诺环素在1～200mg／L的浓度范围内，对细胞形态无影响，可显著促进MRAOBs的增殖和蛋白合成(P＜0.01)，1～100mg／L浓度范围内随着浓度的增加促进细胞增殖和蛋白合成的作用显著增强，至100mg／L时达最大促进效应，而1～200mg／L的米诺环素能显著抑制MRAOBs的ALP活性，随浓度的增加抑制作用逐渐增强。因此选择100mg／L浓度的米诺环素观察其在15min、30min、45min、60min时成骨细胞内的蓄积量，结果显示米诺环素成骨细胞摄取量无显著性差异(P＞＞0.05)，可能已经达到细胞摄入的饱和状态，证明MINO可在成骨细胞内长期保持较高的药物含量。同时，用金黄色葡萄球菌感染MRAOBs，计算细胞内菌落数并透射电镜观察SA侵入成骨细胞的情况，结果显示以60min侵入最多，其次分别为45、30min。最后，将金黄色葡萄球菌侵袭60min的MRAOBs样本分成两部分一部分经过庆大霉素细胞外完全灭菌后再加入100mg／L的米诺环素，仅仅观察米诺环素细胞内的作用，结果显示1～24h可使细胞内SA的数量减少，24h后基本杀灭细胞内细菌；另一部分直接加入100mg／L的米诺环素，细胞内外的细菌随着米诺环素作用时间的延长同时逐渐减少，3h细胞外细菌基本杀灭，24h后细胞内的细菌也基本完全杀灭。 综上所述，一定浓度范围内MINO有促进成骨细胞的增殖，蛋白合成和抑制成骨细胞分化的作用，100mg／L米诺环素可以作为成骨细胞内外抗SA作用的较为适合的参考浓度，且实验证明MINO具有成骨细胞内抗SA的作用。
【学位单位】：中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2007
【中图分类】：R781.4
【部分图文】：

军医进修学院博士学位论文图3一2荧光强度与米诺环素含量关系的标准曲线4001一一一350}愈目。月。吕。。s。台ln山 500100015002000 Standardconcentrationofminocyeline(ng/ml)图3一3光密度值与蛋白质含量关系的标准曲线03025 0.2 00.15O 0.1Y二0.0025X+0.0002 20406080100 standardconeentrationofProtein(林g/ml)25001202.1.2成骨细胞内米诺环素含量(样本测定)在本实验测试条件下用荧光分光光度计测定样本荧光强度，并按回归方程计算出米诺环素浓度;在595nm波长下用紫外分光光度计测得的成骨细胞的蛋白含量的光吸收值代入蛋白标准曲线方程计算出细胞蛋白含量;米诺环

军医进修学院博士学位论文图3一5金黄色葡萄球菌浓度与0D值关系的曲线 1.80E+09160E+09 1.40E+091，20E+09 1.00E+09 8.OOE+086刀OE+08 4.00E+08IE+09X一IE+08 0.shlh 1.sh….2.5h2刀OE+08 0.00E+00.3h︵一已口妈日︶sn。﹄.n，JSO口。.~韶扫。吕。口图3一6金黄色葡萄球菌的生长曲线 1.00E+15鉴 1.o0E十14吸3一ooE+一3l，·。。E+，2巴 1.ooE+l-O吕一ooE+一。票 1.ooE+。9吕O口100E+08_____」Time(h)2.2.2金黄色葡萄球菌对成骨细胞的侵入能力分析金黄色葡萄球菌 ATCC25923对成骨细胞每孔的平均侵入菌落数15min为13士5;30min为435士31;45min为803士95;60min为1800士175。于15min时几乎没有细菌进入成骨细胞，30min有细胞侵入并在1小时范围内随时间的延长细菌侵入成骨细胞的数量增多(因庆大霉素杀灭细胞外细菌后，最后一次洗液的菌落计数范围为O一50CFU/孔，所以如果侵入细胞内细菌菌落数延50CFU/孔就认为成骨细胞内无金黄色葡萄球菌侵入)。金黄色葡萄球菌对成骨细胞的侵袭率=侵入细胞的细菌数功口入细菌的总数。30min为0.0435%。

军医进修学院博士学位论文图l一1成年SD大鼠单侧下领骨图1一2牙拔除后的成年SD大鼠单侧下领骨图大图l一3从成年50大鼠下领骨上拔除的切牙和磨牙l一4酶消法培养的原代成骨细胞体积，呈三角形、长梭形、鳞片状(sd)‘200图!一5骨组织法培养的原代成骨细胞体积列紧呈三角形、长梭形，核圆，核仁明显 (7d)X100图1一6传代成骨细胞(第一代)细胞排大，密呈编织骨样(5d)“200
【参考文献】

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本文编号：2867729