甲型流感病毒H1N1联合牙龈卟啉单胞菌感染肺上皮细胞凋亡与自噬的研究

发布时间：2020-11-03 15:27

　　 目的:牙周病是呼吸道感染疾病的风险因素之一。国内外研究显示牙周病与肺部感染性疾病之间密切相关,牙周袋内的致病菌可以导致老年体弱者或长期住院患者发生肺部感染甚至肺脓肿。在对美国国民健康调查中发现,随着牙周附着丧失的增加,肺功能表现出降低的趋势,此外,牙菌斑的形成可导致厌氧菌的滋生,并通过一系列内在机制导致嗜酸性粒细胞的募集与激活,而肺部疾病也被看作是慢性嗜酸性粒细胞炎症障碍性疾病之一,因此从疾病的发病机制来讲,牙周病与肺部疾病具有相似之处。P.gingivalis(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)在引发牙周组织破坏过程中发挥着重要的作用,能分泌大量的毒力因子,导致牙周组织破坏,是公认的牙周致病菌。P.gingivalis的主要致病物质包括菌毛、纤毛、外膜、荚膜等菌体成分,以及产生的内毒素、蛋白酶等毒力因子。研究表明,P.gingivalis侵入宿主细胞后,其菌毛迅速黏附在宿主细胞表面,通过与定位于脂质筏的细胞表面受体相互作用内吞入胞,导致细胞自噬的发生,自身于胞内自噬体中复制增殖。大量复制的P.gingivalis释放于胞外,其致病物质通过激活Toll样受体和Nod样受体,产生IL-1、TNF-α等促炎因子,从而激发宿主的固有免疫机制。由于慢性牙周炎的早期症状不易引起重视,继而造成牙周组织长期慢性感染,炎症反复发作,不仅损害口腔咀嚼系统的功能,而且与多种系统性疾病相关,近年的研究表明牙周病与呼吸系统疾病有密切的关系,由于口咽与呼吸系统直接相通,El-Solh等人研究显示牙周病与吸入性肺炎、慢性阻塞性肺疾病之间有一定的相关性。流感病毒是阴性的囊膜RNA病毒,流感病毒的8段RNA基因共编码13个蛋白:HA和NA是病毒表面的具有抗原性的糖蛋白,和病毒的致病性有直接关系;脂质双层膜的下面是M1和M2蛋白,M2蛋白是调节自噬的关键蛋白。M2蛋白可以通过阻止自噬体的成熟及自噬体和溶酶体的融合而引发自噬体的形成,而自身可于自噬体内复制增殖。自噬作为真核生物的自我防护机制之一,可以选择性识别和消除入侵病原体。然而有些病原体可以在自噬体的保护下完成其复制,从而颠覆正常的自噬途径。研究表明,P.gingivalis和H1N1以相似的机制利用自噬途径进行生长繁殖,即通过抑制自噬体与溶酶体融合或改变正常的自噬转运而抑制自噬体成熟,分解利用自噬体所包裹的蛋白质而定植在晚期自噬体内,造成感染持续存在。本研究的目的是研究当P.gingivalis和H1N1病毒共同感染肺上皮细胞时,发生宿主细胞凋亡时,自噬的产生对细胞炎症因子的作用,及引起的细胞自噬对凋亡的影响,探讨混合感染对细胞损伤的可能机制。研究方法:研究对象:P.gingivalis标准株:ATCC 33277,中国医科大学口腔医院口腔生物学教研室提供。甲型流感病毒模式株:H1N1 PR/8/34,锦州医科大学病原微生物教研室提供。呼吸道上皮细胞:A549细胞株(人肺腺癌细胞株,ATCC CCL-185),锦州医科大学病原微生物教研室提供。1、甲型流感病毒H1N1联合P.gingivalis诱导肺上皮A549细胞凋亡影响首先P.gingivalis和肺上皮A549细胞的体外培养,甲型流感病毒H1N1的扩增及滴定;其次P.gingivalis和甲型流感病毒H1N1混合感染肺上皮A549细胞时,最佳感染复数的选择。MOI值分别为10:1、50:1、100:1的P.gingivalis感染肺上皮A549细胞,37℃,5%CO_2条件下共同孵育3h后,分别加入MOI值为1:1、2:1、4:1的甲型流感病毒H1N1,感染肺上皮A549细胞;最后以MTT法及FITC Annexin V/PI双染法流式细胞术检测各组A549细胞的存活率及凋亡率。2、甲型流感病毒H1N1联合P.gingivalis诱导肺上皮A549细胞相关炎症因子的表达应用ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测感染的肺上皮A549细胞上清液中TNF-ɑ、IL-1β和IL-6的含量变化。3、甲型流感病毒H1N1联合P.gingivalis诱导肺上皮A549细胞自噬和凋亡的研究通过荧光显微镜、透射电镜观察肺上皮A549细胞自噬的发生,免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3I、LC3II和p62的表达。通过使用3MA抑制肺上皮A549细胞检测凋亡蛋白caspase-3的表达。4、统计学处理应用SPSS 17.0软件进行统计学分析,数据用mean±SD表示,多组比较采用方差分析(两两比较应用S-N-K法),P0.05为差异有统计学意义。结果:1、甲型流感病毒H1N1联合P.gingivalis感染肺上皮A549细胞凋亡的影响。当P.gingivalis MOI值为50:1,甲型流感病毒H1N1 MOI值为2:1时,既可以达到混合感染的最大感染效率又不会造成细胞的大量死亡,可作为后续研究的混合感染复数。MTT结果显示,单独病毒H1N1组的存活率明显低于P.gingivalis+H1N1组(P0.05)。流式细胞术结果显示,单独病毒H1N1组的细胞凋亡率明显高于P.gingivalis+H1N1组(P0.05)。2、甲型流感病毒H1N1与P.gingivalis共同感染肺上皮A549细胞炎症因子的表达。与对照组相比,实验组产生的炎症细胞因子TNF-ɑ、IL-1β和IL-6的浓度均显著升高,随着时间的延长,表达量升高,P0.05;当P.gingivalis MOI值为50:1,随着流感病毒H1N1量的增加,TNF-ɑ、IL-1β和IL-6的表达增多,P0.05。3、甲型流感病毒H1N1和P.gingivalis诱导肺上皮A549细胞自噬和凋亡的研究。电镜检测P.gingivalis和流感病毒H1N1作用于肺上皮A549细胞后自噬体的形成,荧光显微镜结果显示P.gingivalis+H1N1组的GFP-LC3表达显著增加;western blotting检测各组自噬相关蛋白LC3I、LC3II和p62的表达结果显示,12h及24h时间点LC3II/LC3I表达由高到低为:混合感染组单独流感病毒H1N1组单独P.gingivalis组对照组,p62的表达则相反。使用自噬抑制剂3MA处理后,结果显示LC3II/LC3I比率显著较低,但caspase-3水平显著较高(P0.05)。结论:1、P.gingivalis作为一种牙周致病菌能够定植于呼吸道上皮细胞,使上皮细胞发生凋亡坏死,甲型流感病毒H1N1也能够定植于呼吸道上皮细胞,使肺上皮细胞大面积凋亡坏死。若机体同时感染P.gingivalis和甲型流感病毒H1N1,在一定感染浓度情况下,则会暂时抑制肺上皮细胞凋亡。2、甲型流感病毒H1N1对P.gingivalis诱导肺上皮A549细胞产生炎症因子起增强作用。甲型流感病毒H1N1可增加炎症因子的产生,造成严重不可逆的肺部损伤。3、甲型流感病毒H1N1联合P.gingivalis可以诱导肺上皮A549细胞产生自噬。使用自噬抑制剂3MA可以明显抑制P.gingivalis和甲型流感病毒H1N1诱导的肺上皮A549细胞自噬,并促进凋亡的发生,提示自噬能够拮抗凋亡的发生。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R781.4
【部分图文】：

中国医科大学博士学位论文3 结果3.1 MTT 法检测肺上皮细胞 A549 细胞的存活率此部分实验旨在寻求混合感染时P. gingivalis与流感病毒H1N1搭配的最佳感染复数，当 P. gingivalis MOI 值为 10:1，混合感染与流感病毒 H1N1 单独感染之间比较无统计学意义，当 P. gingivalis MOI 值为 100:1 时，混合感染的细胞存活率接近为 0，上述两个 MOI 值均不适合进行后续研究。我们发现当流感病毒 H1N1 MOI值为 2:1、P. gingivalis MOI 值为 50:1 时，既可以达到混合感染的最大感染效率又不会造成细胞的大量死亡，可作为后续研究的混合感染复数。

中国医科大学博士学位论文同 MOI 值单独病毒 H1N1 组的比较，P<0.05。3.2 倒置显微镜下观察肺上皮细胞 A549 细胞形态变化如图 2 所示，混合感染 12h（图 2A)后，肺上皮细胞 A549 细胞形态改变如下，空白对照组细胞之间紧密相连，呈梭型或不规则型贴壁生长，生长旺盛，轮廓清晰；单独 P. gingivalis 组细胞以完整的单层细胞存在，大多数的细胞没有表现出形态学上的萎缩、变形和分离；混合感染组出现细胞密度降低，贴壁能力变差；单独 H1N1组部分细胞出现变圆、脱落、聚集等现象。混合感染 24h（图 3.2B）后，处理组A549 细胞形态均发生变圆、脱落、聚集，病毒组及混合组病变更为明显。

中国医科大学博士学位论文细胞。分别计数四组细胞比例并在不同因素处理组进行比较。各处理组中细胞的比例均小于 5%，12h 时间点各处理组凋亡率均较阴性对照组.000。各处理组两两比较凋亡率，各组之间存在显著性差异，P=0.000，单1N1组>混合感染组>单独P. gingivalis组。24h时间点各处理组两两比较凋.000，单独病毒 H1N1 组>混合感染组>单独 P. gingivalis 组（图 3.3）。
【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 张慧锋;李妍;白雪;刘珊;;mTOR信号通路及其抑制剂的研究进展[J];中国畜牧兽医;2013年02期

2 ;Effect of Porphyromonas gingivalis PrtC on cytokine expression in ECV304 endothelial cells and its level in subgingival plaques from patients with chronic periodontitis[J];Acta Pharmacologica Sinica;2007年07期

本文编号：2868759