牙周炎是由菌斑生物膜引起的牙周组织的感染性疾病,能够导致进行性的附着丧失,牙周袋的形成及牙槽骨吸收,是成年人失牙的主要原因。牙周膜成纤维细胞作为牙周膜中的主体细胞,在牙周组织的病变,修复及再生过程中发挥了重要作用,培养牙周膜成纤维细胞建立体外模型,是研究牙周组织疾病的重要手段之一。牙龈卟啉单胞菌为慢性牙周病的主要致病菌,脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)是其细菌外膜的主要成分,是重要的炎症启动因子。LPS能够通过破坏牙龈结合上皮进入牙周组织,被Toll样受体识别,诱导牙周膜成纤维细胞释放出IL-6,IL-8,IL-1β,TNF-a,IL-10等多种炎症相关因子,加重牙周组织的炎症反应,是导致牙周组织破坏的重要毒力因子。Toll样受体是参与天然免疫的一类重要蛋白质分子,通过识别病原相关分子模式,引起细胞内信号传导通路,激活靶基因,释放炎症因子,启动炎症反应。Toll样受体家族中的不同Toll样受体可以识别不同的配体,其中TLR-2及TLR-4主要参与了LPS的识别及信号转导,在LPS诱导下的炎性反应中发挥着至关重要的作用。一氧化碳为一种重要的气体信号分子,在机体组织和细胞内能够发挥抗炎及抗凋亡的作用。一氧化碳释放分子是一种由过渡金属组成的新型金属-碳基化合物,已被证实可在特定条件下缓慢释放一定量的CO并发挥生物学效应。前期研究已发现,CORM-3对于炎性因子诱导下人牙龈成纤维细胞粘附分子的表达具有抑制作用,抑制了免疫细胞向牙周组织的粘附、浸润和迁移,继而减轻宿主的炎性病理反应。提示我们应用CORM-3治疗牙周炎的可行性。基于以上背景,本实验通过检测CORM-3对LPS诱导下牙周膜成纤维细胞IL-6,IL-8,IL-10的分泌,TLR2,TLR4mRNA及蛋白的表达的影响,初步探讨CORM-3对脂多糖诱导的人牙周膜成纤维细胞炎性反应的影响。材料和方法第一部分人牙周膜成纤维细胞的体外培养及鉴定于山东大学口腔医院,收集15-25岁正畸志愿者牙周和牙体均健康的新鲜拔出的前磨牙或智齿,无菌条件下刮取根中1/3的牙周膜组织,组织块法培养原代细胞,酶消法进行传代。取原代培养的人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligamentcells,hPDLC)及培养至第3代的细胞,于倒置相差显微镜下观察其形态和特征。采用免疫组织化学染色法,通过波形蛋白和角形蛋白染色对其鉴定细胞来源。第二部分CORM-3对LPS诱导的人牙周膜成纤维细胞炎症因子释放的影响研究培养人牙周膜成纤维细胞(同第一部分),取第4~6代生长状态良好的细胞用于实验。将细胞随机分为空白对照组,LPS组,LPS+CORM-3 100μM组,LPS+CORM-3 200μM组,LPS+CORM-3 400μM 组。空白组不加任何刺激。LPS组以 10μg/mL p.g.LPS 刺激细胞24h,LPS+CORM-3 各组先分别以CORM-3(100μM,20(μM,400μM)预处理细胞24h后,再加入 1Oμg/mL p.g.LPS刺激24h,收集细胞上清液,ELISA法检测各组上清液中IL-6,IL-8,IL-10等因子的表达。第三部分CORM-3对LPS诱导人牙周膜成纤维细胞TLR-2和TLR-4表达的影响研究培养人牙周膜成纤维细胞(同第一部分),取第4～6代生长良好的细胞用于实验。随机分为空白对照组,LPS组,LPS+CORM-3组,LPS+失活CORM-3组及CORM-3组,空白组不加任何刺激。LPS组以10μg/mLp.g.LPS刺激24h,LPS+C0RM-3组先以400μM C0RM-3预处理24h后,再加入10μg/mL p.g.LPS刺激24h,LPS+失活CORM-3组以完全释放掉CO的失活的CORM-3预处理细胞24h,再加入10μg/mL p.g.LPS刺激24后,提取细胞总RNA,进行实时定量PCR方法检测TLR-2,TLR-4的mRNA表达;收集细胞,以流式细胞技术检测TLR-2,TLR-4的蛋白的表达。结果第一部分 人牙周膜成纤维细胞的体外培养及鉴定原代培养的牙周膜成纤维细胞呈长梭形,有长短不等的细胞突起,胞核呈卵圆形或圆形,符合成纤维细胞的形态特征。培养至第4代的细胞形态仍保持不变,生长速度较快。免疫组织化学染色显示:细胞抗波丝蛋白染色呈阳性,抗角蛋白染色呈阴性,证明细胞来源于中胚层。第二部分CORM-3能够抑制LPS诱导的人牙周膜成纤维细胞炎症因子释放ELISA结果显示:1Oμg/mL p.g.LPS刺激后,hPDLCs分泌的IL-6、IL-8及IL-10的量较空白对照组均有明显增高(p0.05)。以CORM-3预处理后的各组细胞,IL-6、IL-8的表达较LPS组比较均出现显著下降(p0.05),上清液中IL-10的分泌较LPS有显著上调(P0.05),并呈浓度依赖性。LPS+400μM CORM-3组IL-6、IL-8表达下调作用最为显著,同时,该组的IL-I0表达上调作用也最为显著(P0.05)。第三部分CORM-3能够抑制LPS诱导的人牙周膜成纤维细胞TLR-2和TLR-4表达实时定量PCR结果显示:10μg/mLp.g.LPS刺激后,hPDLCs TLR-2mRNA的表达约为空白对照组的2倍(p0.05),TLR-4 mRNA表达约为空白对照组1.2倍(p0.05),以CORM-3预处理后的各组细胞,TLR-2、TLR-4 mRNA的表达较LPS组比较均出现显著下降(p0.05),LPS+失活CORM-3组较LPS组各基因表达无明显差异。CORM-3组较空白对照组各基因表达无显著差异。流式细胞技术结果显示:10μg/mL p.g.LPS刺激后,HPDLCs TLR-2表面抗原表达为空白对照组的2.5倍(p0.05),TLR-4表面抗原表达为空白对照组2倍(p0.05),以CORM-3预处理后的各组细胞,TLR-2、TLR-4表面抗原表达较LPS组比较均出现显著下降(p0.05)。LPS+失活CORM-3组较LPS组各表面抗原表达无显著差异。CORM-3组较空白对照组各表面抗原表达无明显差异。结论1、组织块法培养hPDLCs 一般游出时间为7-14天,结合免疫组织化学染色结果,说明培养的hPDLCs来源可靠,细胞纯度高。2、LPS刺激后,hPDLCs中IL-6,IL-8,IL-10等细胞因子的分泌显著增强。CORM-3对LPS诱导的hPDLCs中IL-6,IL-8等炎症因子的分泌有显著抑制作用,并对抗炎因子IL-10有显著上调作用,且伴有一定的浓度依赖性。3、LPS刺激后,hPDLCs中TLR-2,TLR-4的表达明显升高,400μMCORM-3能够显著的抑制LPS诱导的hPDLCs中TLR-2,TLR-4的表达。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R781.4
【部分图文】：
镜下可观察到，少量细胞从组织块边缘游出，细胞以组织块为中心呈放射状生长，??细胞多呈长梭形或星形，一般有２－４个胞突，胞核呈卵圆形或圆形，位于胞质中??心，与成纤维样细胞形态相似（图１）。一般细胞从组织块游出到长满瓶底８０％??需要１４－２０ｄ，继而传代，贴壁后细胞增值速度加快，一般４－５ｄ细胞密度即可达??到瓶底的８０％，传代后的细胞仍保持成纤维样细胞的状态，长满单层后呈放射状??或旋涡状排列（图２），本实验选取４－６代人牙周膜成纤维细胞用于后续实验。??图１组织块培养法第８天（２００ｘ）：长梭形细胞以组织块为中心呈放射状生长??．．．塗??图２传代培养第４代第５天（２００ｘ）：细胞长满单层后呈放射状或旋涡状排列??１６??
需要１４－２０ｄ，继而传代，贴壁后细胞增值速度加快，一般４－５ｄ细胞密度即可达??到瓶底的８０％，传代后的细胞仍保持成纤维样细胞的状态，长满单层后呈放射状??或旋涡状排列（图２），本实验选取４－６代人牙周膜成纤维细胞用于后续实验。??图１组织块培养法第８天（２００ｘ）：长梭形细胞以组织块为中心呈放射状生长??．．．塗??图２传代培养第４代第５天（２００ｘ）：细胞长满单层后呈放射状或旋涡状排列??１６??
细胞抗波丝蛋白阳性(200x)
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本文编号：
2876785
