小鼠来源诱导多能干细胞定向分化为成牙本质样细胞体外实验研究

发布时间：2020-11-12 07:11

　　 目的:明确DNCP微环境下小鼠iPS细胞向成牙本质样细胞分化的效果及探讨BMPs对诱导分化过程的影响及可能机制。方法:实验第一部分:将购买的小鼠iPS(OSKM体系)复苏、与小鼠MEF共培养环境下用iPS细胞基础培养基进行扩增、传代,继而用iPS细胞分化培养基悬滴培养3d后转入低黏附培养皿中悬浮培养制备拟胚体。用倒置显微镜观察iPS克隆团的形态特点和拟胚体的形成过程。悬浮培养2d免疫荧光法检测拟胚体多能干细胞标志性基因Oct-4、Sox-2的表达。实验第二部分:从小鼠离体牙中提取DNCP,采用MTT法确定DNCP最佳作用浓度,各组实验浓度设定为100ng/ml,500ng/ml,1000ng/ml,10000ng/ml。收集拟胚体,参照MTT实验结果设计四组:自分化对照组、添加500ng/ml的DNCP、添加500ng/mlDNCP+50ng/ml的Noggin、添加500ng/mlDNCP+25ng/ml BMP-2+25ng/ml BMP-4四组定向分化,连续培养10d,运用qRT-PCR检测各组成牙本质细胞特异性标志物DMP-1、DSPP及相关通路基因Msx-1表达。运用Western-blot检测各组p38和Smad-4蛋白表达及磷酸化水平。结果:共培养环境下小鼠iPS细胞克隆团样生长,克隆团呈小的球形,细胞形态较一致,排列紧密。悬滴培养3d和悬浮培养2d形成拟胚体的散在分布,形态均一,体积较大,实性型,可见细胞多形性。第5d拟胚体免疫荧光实验显示Oct-4和Sox-2阳性表达。MTT结果示500ng/mlDNCP处理组小鼠iPS细胞具有最佳的存活率和增殖能力。QRT-PCR结果:经DNCP诱导10d后,小鼠iPS细胞阳性表达DSPP、DMP-1,添加Noggin后,DSPP、DMP-1表达相较于DNCP组减少(P0.05)。若在DNCP组的基础上添加外源性BMPs,DSPP、DMP-1表达明显增加(P0.05)。各组Msx-1基因的表达趋势与DSPP、DMP-1表达相同。Western blot显示:DNCP组相较于空白对照组p38/p-p38和Smad4/p-Smad4的表达均有所增加(P0.05)。在DNCP组的基础上添加Noggin,两类通路蛋白并未明显增加。若改为添加BMPs混合液,p38和Smad4表达相较与DNCP组有明显增加,(P0.05),且及两者的活化水平亦相应增加(P0.05)。结论:500ng/mL的DNCP微环境可诱导小鼠iPS细胞向成牙本质样细胞分化。BMP/Smad和BMP/p38信号通路在其中发挥了重要作用。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R78
【部分图文】：

贴壁后用 4%多聚甲醛固定 15～20 分钟；②PBS 浸泡洗，10min×3 次；③0.riton X-100 破膜 10min，PBS 浸泡洗，10min×4 次。④一抗工作液（用 2% B稀释比例为 1:200 稀释抗体），4℃孵育过夜。次日室温平衡 30min，PBS洗，10min×4 次；⑤二抗工作液（用 2% PBS 以稀释比例为 1:1000 稀释）37育 60min，1×PBS 浸泡洗，10min×4 次；⑥DAPI 复染 5min，PBS 浸泡洗0min×3 次；⑦晾干封片，拍照。.3 实验结果.3.1 诱导式多能干细胞的形态学观察大约第 5 天共培养集落出现 iPS 细胞克隆团，周围由梭性 MEF 包绕。镜期克隆团呈不规则球形细胞，较小，边界清楚。细胞簇内细胞高度同质化构致密，核浆比高，核仁明显。彼此排列紧密，细胞界限不清。

图 1.2 拟胚体形成结果，图中标尺为 10 μm免疫荧光结果对悬浮生长在分化培养基的 2d 的小鼠 iPS 细胞多能性基因 Oct-4、Sox-2鉴定，两者均呈阳性表达。说明 iPS 细胞形成拟胚体初期仍具有具有良好的性。.3.3

小鼠iPS细胞拟胚体全能性基因免疫荧光化学分析，图中标尺为20μm
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本文编号：2880439