bFGF基因转染对骨髓间充质干细胞成骨能力影响的研究

发布时间：2020-11-12 17:16

　　 1.兔BMSCs细胞成骨方向诱导培养及鉴定 目的:探究骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化过程中基因表达模式。方法:抽取兔股骨远端骨髓,全骨髓贴壁法培养获得骨髓间充质干细胞,用条件培养基进行诱导,用RT-PCR的方法检测ALP、OPN、collagen-Ⅰ、bFGF和OC基因的表达,并对BMSCs表面抗原CD44及ALP活性进行鉴定。结果:诱导培养后,OPN、、ALP、collagen-Ⅰ、OC、bFGF基因分别于第1、2代细胞正常表达,BMSCs诱导培养第一代检测抗原CD44阳性率达44.4%,ALP含量增高无统计学意义。结论:兔骨髓间充质干细胞在体外诱导培养中自原代到第2代逐渐向成骨细胞分化,成骨细胞特异性基因顺序表达,已具备成骨细胞特征,此为进一步探讨骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化基因表达机制提供了实验依据。 2.bFGF-慢病毒真核表达载体构建及转染 目的:构建携带人bFGF基因的慢病毒载体,构建携带GFP基因的慢病毒载体作为对照,分别转染成骨方向诱导的BMSCs,鉴定bFGF和GFP基因的表达。方法:设计人bFGF基因引物,用Trizol法提取胎盘组织RNA,用RT-PCR的方法扩增出bFGF基因,连接至pLenti6/V5-D-TOPO?表达质粒,经Xho-Ⅰ、BamH-Ⅰ双酶切和DNA测序证实质粒正确构建。在脂质体转染剂Lipofectamine 2000的介导下,bFGF-pLenti6/V5-D-TOPO表达质粒同包装质粒pLP1、pLP2、包膜质粒pLP/VSVG共转染293FT细胞株,收集bFGF-慢病毒上清转染诱导后第2代的兔BMSCs。设计GFP基因引物,以GFP-PMSLV-Plazmid为模板,PCR的方法扩增出GFP基因,连接至pLenti6/V5-D-TOPO?表达质粒,GFP-慢病毒载体的构建及转染BMSCs过程同bFGF-慢病毒。RT-PCR方法检测bFGF mRNA水平的表达。结果:转染48小时后,对照组BMSCs可见绿色荧光蛋白表达,转染15天后RT-PCR方法扩增出bFGF基因,1.5%琼脂糖凝胶电泳显示目的基因片段大小一致。结论:成功构建携带人bFGF和GFP基因的真核表达载体,建立转染兔BMSCs的方法,可作为组织工程骨的种子细胞用于进一步研究。
【学位单位】：新疆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2009
【中图分类】：R78
【部分图文】：

薄的胞质突起，细胞核圆形或椭圆形，有多个核仁，胞浆中有黑色颗粒。传代后的BMSCs 生长较为缓慢（见图 1-2）。图1-1 原代BMSCs（×40） 图1-2 诱导后BMSCs（×40）1.2.2 BMSCs 生长曲线诱导培养中，接种第 2 天的 BMSCs 数量少于第 1 天接种时的数量，第 2 天到第5 天为增殖期，第五天达到最高峰，第五天至第八天逐渐减少(见图 1-3)。

诱导后BMSCs（×40）

图1-3 BMSCs生长曲线SCs 增值活力BMSCs 以 1×105/ml 接种于 96 孔板，连续培养 6 天可见第三天细胞增殖活跃，第三天到第六天增殖能力逐渐图1-4 BMSCs MTT值胞标志性基因在 mRNA 水平的表达
【引证文献】

相关硕士学位论文 前1条

1 唐小雪;bFGF基因转染对羊骨髓间充质干细胞成骨调节作用的研究[D];新疆医科大学;2012年

本文编号：2881014