基于自噬水平研究X射线对成骨细胞的作用

发布时间：2020-11-13 21:34

　　 目的:探讨X射线对MC3T3-E1小鼠成骨细胞增殖、凋亡和矿化能力的影响,并从自噬角度初步阐述其可能的分子机制。方法:体外培养MC3T3-E1细胞,以6MV/min剂量脉冲速率的医用直线加速器照射,分组如下:空白对照组、0.25 Gy组、0.5 Gy组、1 Gy组、2 Gy组和4 Gy组。采用MTT法筛选多西环素(doxycycline,DOX)作用浓度,通过单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)染色法确定DOX抑制自噬现象的作用时间,筛选多西环素浓度为2.5nM时干预48h对上述分组进行自噬抑制。采用MDC染色法观察X线照射72h后的自噬现象;平板克隆实验检测细胞的增殖活力;成骨诱导21天后茜素红染色观察矿化结节数量;ALP试剂盒检测矿化能力;Hoechst 33342染色和流式细胞术检测成骨细胞凋亡情况;免疫印迹法检测蛋白LC3、Atg5、Beclin-1、p62、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Runx2的表达。结果:平板克隆实验显示各辐照组细胞增殖活力明显降低(P0.05),且有剂量依赖性;茜素红染色和ALP检测显示,辐照组的矿化结节数量减少(P0.05),矿化程度降低,ALP活性降低,且有剂量依赖性;单丹磺酰尸胺(MDC)染色显示,各实验组随着辐照剂量的增加,荧光强度均有增加;Hoechst 33342细胞凋亡形态学观察发现辐射组在72h后细胞核凝聚数量显著增多,凋亡小体数目明显增多;流式细胞术结果显示辐照组随着剂量和时间的增加,细胞凋亡率上升(P0.05);Western blot检测显示Beclin-1、Atg5、Lc3 II/Lc3 I和除0.25 Gy外的Caspase3蛋白相对表达量随着辐射剂量的增加均明显上调,差异具有统计学意义(P0.01);p62和Bcl-2/Bax蛋白表达量明显下调,差异具有统计学意义(P0.01);Runx2的表达除0.25 Gy外明显下调,差异具有统计学意义(P0.01)。MDC染色结果显示加入2.5nM DOX干预48h后,各辐照组荧光强度基本消失;平板克隆实验显示加DOX组细胞增殖活力增高(P0.05);茜素红染色和ALP检测显示加DOX组细胞矿化结节数量增多(P0.05),ALP活力升高;Hoechst 33342细胞凋亡形态学观察发现加DOX组48h,凋亡小体数目增多;流式细胞术结果显示加DOX组凋亡率增高(P0.05);Western blot检测Beclin-1、Atg5、Lc3 II/Lc3 I和除0.25 Gy外的Bcl-2/Bax蛋白相对表达量明显下调,差异具有统计学意义(P0.05);p62在辐射剂量1 Gy-4 Gy时蛋白表达量下调,差异具有统计学意义(P0.05);Runx2的表达量均明显上调,差异具有统计学意义(P0.05);Caspase3在辐射剂量2 Gy和4 Gy时蛋白表达量上调,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:X射线可体外诱导MC3T3-E1成骨细胞发生凋亡;抑制自噬后,凋亡加重,其机制可能通过激活线粒体释放凋亡酶激活因子Caspase-3蛋白有关。X射线可体外抑制MC3T3-E1成骨细胞的矿化能力;抑制自噬后,可减轻X射线对成骨细胞矿化能力的损伤,其机制可能与上调ALP活力和成骨相关基因Runx2有关。
【学位单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R739.8
【部分图文】：

兰州大学研究生学位论文 基于自噬水平研究 X 射线对成骨细胞的作用2.4 实验结果2.4.1 多西环素作用浓度的筛选采用 MTT 法分别检测加入不同浓度的多西环素后 24h、48h、72h MC3T3-E1成骨细胞的存活率。结果显示，多西环素浓度为 2.5nM 时干预 24h、48h 后生存率与空白对照组没有显著差异（P>0.05），并结合 MDC 染色发现多西环素在 2.5nM时抑制自噬48h其抑制效果最好，因此，选取多西环素的作用浓度为浓度为2.5nM。

图 2 MDC 染色法观察单纯辐照组和 DOX+辐射组 MC3T3-E1 的自噬情况（。放大倍数 200×）Fig. 2 MDC staining was used to observe the autophagy of MC3T3-E1 in the irradiation groupand the DOX+ radiation group. (Magnification 200×).2.4.3 单纯 X 射线和抑制自噬后对 MC3T3-E1 成骨细胞增殖活力的影响通过克隆形成实验，能够很好的评价细胞对射线的敏感性，平板克隆实验中，将细胞接种于培养皿后，通过镜下观察细胞数>50 个时算作 个克隆。结果显示，随着辐射剂量的增加，单纯辐照组的克隆形成率逐渐降低，呈剂量依赖性，差异有统计学意义（P ＜0.01）。辐照后加入 DOX 抑制自噬后，与单纯辐照组相比，除 0.25 Gy 外，同 剂量下抑制自噬后的 MC3T3-E1 的克隆形成率增高，差异有统计学意义（P ＜0.05）。

图 3 细胞平板克隆实验观察单纯辐照组和 DOX+辐射组 MC3T3-E1 的增殖情况。(A) 单纯辐照组和 DOX+辐射组的增殖活力比较；(B) 单纯辐照组和 DOX+辐射组增殖率的数据统计。注：与 Control 组比，##P<0.01，与单纯辐照组相比，*P<0.05，**P<0.01Figure 3 Colony formation assay to observe the proliferation of MC3T3-E1 cells irradiated withDOX+radiation alone. (A) Comparison of the proliferation activities of the radiation-only andDOX+ radiation groups; (B) Data statistics of the proliferation rate of the radiation-only and DOX+radiation groups.Note: Compared with Control group, ##P<0.01, compared with radiation alone group, *P<0.05,**P<0.012.4.4 单纯 X 射线和抑制自噬后对 MC3T3-E1 成骨细胞矿化及 ALP能力的影响⑴采用茜素红染色观察 X 射线对 MC3T3-E1 成骨细胞矿化能力的影响，结果显示，随着辐射剂量的增加，其矿化结节数量明显减少，差异有统计学意义（P<0.01）；辐照后加入 DOX 抑制自噬后，与单纯辐照组相比，辐射剂量 2 Gy 和4 Gy 时矿化结节数量增多，差异有统计学意义（P<0.05）如图 4A、B、C 所示。
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本文编号：2882678