牙周膜干细胞膜片在牙周再生中的实验研究

发布时间：2020-11-23 14:35

　　 牙周病的细胞治疗是近年来牙周医学研究的热点,传统的细胞移植途径存在诸多的不足:离散细胞间缺乏必需的细胞外基质与活性分子,细胞定植困难,导致无效移植,因而难以确定移植细胞的量效关系;外源性支架材料的应用一定程度上解决了种子细胞植入载体的问题,但同时,支架材料的降解过程可不同程度地引发对宿主的免疫反应与毒性反应,且存在着对种子细胞营养物质传递的阻挡,这些变化可改变局部微环境,干扰病损区的组织改建过程。膜片技术通过刺激细胞外基质的合成与改建将细胞紧密联系,形成一种不需要胰酶作用而获取种子细胞的移植模式,其操作简便,能够模拟体内细胞微环境,保存细胞间以及细胞-细胞外基质间丰富的信号,因而更有利于种子细胞生物学活性的发挥。但在刺激膜片内细胞外基质合成与改建的同时,因细胞-细胞外基质的相互作用对细胞的生物学性能可能造成了一些不稳定的影响,尤其是在三维培养过程中,基质蛋白三维结构的重建可能限制了对膜片内细胞的营养供应,导致膜片内细胞的分化及凋亡。膜片工程的牙周应用因根面病理特征、牙周解剖结构、口颌系统功能等牙周微环境的特殊性,不利于充分发挥其生物活性。因此有必要明确微环境因素、细胞因素对膜片及种子细胞生物学性能的影响,进一步优化膜片的制备和对牙周微环境的改善,提高膜片的物理机械和生物学性能,以适应复杂牙周微环境再生的需要,拓展牙周组织工程的应用范围。基于以上设想,本课题设计为以下三个部分六个实验: 第一部分单层牙周膜干细胞膜片的制备与鉴定 实验一SD大鼠单层牙周膜干细胞膜片的制备与鉴定 为了评价SD大鼠牙周膜干细胞的生物学活性及诱导成膜的能力,采取组织块消化法对SD大鼠牙周膜干细胞进行分离培养,并对获取的牙周膜干细胞和制备的单层牙周膜干细胞膜片进行鉴定。结果显示:采用组织块消化法培养的牙周膜干细胞为异质性细胞群,具有间充质干细胞的特性,有较强的成骨能力;根据细胞形态确定接种密度的方式有利于膜片的成膜,膜片的细胞外基质含量更为丰富,能够形成牙周膜/牙骨质样复合物。结果说明SD大鼠的牙周膜干细胞具有较强的骨向分化能力,膜片内干细胞能够再生出不同比例的牙周矿化和非矿化组织。 实验二骨诱导环境对牙周膜干细胞膜片制备与生物学性能的影响 为了利用膜片的成骨潜能,构建出一种有利于大面积牙周骨缺损修复的细胞膜片,观察比较了骨替代物与膜片直接和间接共培养对单层细胞膜片生物学性能的影响。结果显示:骨替代物的直接接触培养存在着量效关系,过大的接种密度可导致种子细胞的坏死,不易成膜;骨替代物的间接诱导作用更有利于保持膜片内细胞的生物学活性,并提高膜片的矿化能力。结果说明优化骨诱导环境对于提高膜片的成骨能力具有积极的意义。 第二部分牙周膜干细胞膜片三维聚合体的优化 实验一SD大鼠多层牙周膜干细胞膜片三维聚合体的制备与鉴定 为了提高膜片的物理机械性能,优化膜片的生物学性能,采用SD大鼠牙周膜干细胞单层细胞膜片分次叠加,制备成多层细胞膜片而后复合成细胞膜片聚合体的模式,并比较几种膜片功能学的差异。结果显示:多层细胞膜片的聚合过程更有利于保证膜片间的有机结合,聚合体的物理机械性能和组织再生性能均得到提高。结果说明多层细胞膜片良好的生物学性能有利于合成功能更为全面的聚合体,提升牙周膜干细胞的牙周再生潜能。 实验二不同膜片构建模式对种子细胞生物学性能的影响 为了评价膜片的三维培养模式对细胞活性的影响,动态观察比较了不同三维培养方式对膜片的细胞外基质含量与内部细胞生物学活性的影响。结果显示:多层细胞膜片较单层细胞具有更为丰富的细胞外基质和致密的结构,有利于确保聚合体的三维制备过程中膜片间的有机联系和细胞的活性,提高其组织再生潜能。结果说明优化和/或改建细胞外基质结构是三维聚合体内细胞生物学活性的保证。 第三部分牙周膜干细胞膜片在牙周再生中的应用 实验一不同根面处理模式对牙周膜干细胞膜片生物学性能的影响 为了优选出适宜于膜片再生需要的牙周根面处理模式,改善牙根的生物相容性,本研究比较了不同根面化学处理方式对细胞膜片生物学活性的影响。结果显示:经17%EDTA处理的根面较其它化学处理方式更利于细胞膜片的吸附和增殖,并可诱导细胞的分化和提高再生组织的潜能。结果说明17%EDTA能够有效地改善根面微环境,可以作为SD大鼠牙周再生根面处理的优选模式。 实验二牙周膜干细胞膜片在牙周移植中的作用 为了观察微环境对三维聚合体的牙周再生潜能的影响,比较了单层细胞膜片和多层细胞膜片聚合体在急性牙周缺损以及颌骨模型的再生疗效。结果显示:特殊的牙周微环境降低了膜片的可操作性及牙周再生的有效性,三维聚合体较单层细胞膜片更有利于适应复杂的口颌系统微环境,再生出规则的牙周组织,但部分牙周膜干细胞膜片在颌骨环境内将导致根面的骨性粘连。本研究结果说明三维聚合体在牙周再生中具有一定的生物学优势,但仍有必要对三维聚合体的生物学性能及可操作性继续改进与完善。
【学位单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2010
【中图分类】：R781.4
【部分图文】：

图1.1 rPDLSC 的分离培养及鉴定的 SD 大鼠磨牙；B：有限稀释法体外分离扩增 rPDLSCs，：体外分离培养的第五代 rPDLSCs 未出现老化；D：成骨诱成脂诱导油红 O 染色阳性图 1.2 rPDLSCs 的鉴定性率为 99.7%; B: STRO-1 阳性率为 11.7%；C：CD146 阳性-103-

图1.1 rPDLSC 的分离培养及鉴定：完整拔除的 SD 大鼠磨牙；B：有限稀释法体外分离扩增 rPDLSCs，呈典型克生长；C：体外分离培养的第五代 rPDLSCs 未出现老化；D：成骨诱导茜素红阳性；E：成脂诱导油红 O 染色阳性

图 1.3 rPDLSCs 免疫组化观察-I, Fibronectin，Laminin, OCN, ALP, ON 均为阳性表达图 1.4 rPDLSCs 单层细胞膜片的制备DLSCs 细胞膜片培养 5d、7d、14d；D：成熟的 rPDLSCs 细
【引证文献】

相关博士学位论文 前2条

1 唐雪鹏;骨髓基质干细胞与牙周膜干细胞膜片在牙周组织再生的实验研究[D];第四军医大学;2012年

2 于新波;牙龈间充质干细胞与牙周膜干细胞膜片牙周再生能力的实验研究[D];山东大学;2014年

本文编号：2894718