Trb3基因shRNA载体的构建及对舌鳞癌细胞增殖和凋亡的影响

发布时间：2021-01-22 22:39

　　目的：本课题拟构建靶向人Trb3的shRNA真核表达载体及稳定表达Trb3 shRNA的舌鳞状细胞株,检测其对靶基因的沉默效果、观察其对舌鳞癌细胞Tca8113增殖和凋亡的影响,并初步探讨其机制。方法：运用分子克隆技术构建靶向人Trb3 shRNA载体pSUPER-shTrb3;逆转录病毒方法建立稳定干扰内源性Trb3基因的舌鳞癌细胞株；Western Blot、Real-timePCR技术检测靶基因Trb3的表达情况,流式细胞术检测细胞增殖及凋亡情况,Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达。结果：酶切及测序证实成功构建了靶向人Trb3基因的shRNA真核表达载体,利用逆转录病毒方法成功建立了稳定表达Trb3 shRNA的舌鳞癌细胞株,Real-time PCR、Western Blot证实重组质粒组细胞Trb3 mRNA和蛋白表达水平相对于空载体细胞组显著下降（P<0.05）。流式细胞术证实在内质网应激条件下干扰内源性Trb3可促进舌鳞癌细胞增殖,抑制细胞凋亡,同时凋亡相关蛋白cleaved-caspase 3、7、cleaved-PARP表达下调。结论：内质网应激状态... 

【文章来源】：昆明医科大学云南省

【文章页数】：56 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

重组质粒psUPER一sh介h3酶切鉴定M:oL15000Marker:l:PsUPER一vector:2:shTrb3#l:3:shTrb3#2:4:shTrb3#3

GAPDH月...月.，3‘r.卜那1川礴 2..礴3图SW七 stcrnBlot检测各组细胞Trb3蛋白表达水平 Ser:Tcas113一ser细胞;sh#l:TCasll3一sh#3细胞(P值scr Tcas113一sh#l细胞 :sh#2:Tcas113一sh#2细胞;sh#3: vssh#l:0.024;servssh#2:0.015;scrvssh#3:0.038)

扰效果明显，可以用于下一步实验研究。选用干扰效果较好的细胞 Tcas113一sh#2、 Tcas113·sh#3及对照细胞 Tcas113一scr。图6显示的是在ERS条件下干扰内源性Trb3基因舌鳞癌细胞的增殖系数。图6A为刚被染色的原代细胞 Tcas113，其荧光强度最强。细胞被染色后继续培养，随着细胞分裂，CFSE被平均分配至子代细胞中而使细胞的平均荧光强度减弱。细胞经过培养后，分裂的细胞越多，平均荧光强度就越弱。该组图横坐标为细胞荧光强度，纵坐标为细胞数，根据细胞荧光强度的分布图，可得出细胞的增殖系数。细胞平均荧光强度越小，增殖系数越大，表明细胞增殖越快。该组图显示，图 6B:Tcas113一ser细胞组细胞增殖系数为 12.41;图6C:干扰肠b3后的 Tcas113-sh#2细胞组细胞增殖系数 31.10;图6D:干扰肠b3后的 Tcas113一sh#3细胞组细胞增殖系数为30.68，证明在ERS条件下


本文编号：2994030