兔口腔黏膜上皮干细胞培养构建组织工程黏膜的初步研究

发布时间：2021-01-26 20:08

　　角膜缘干细胞缺陷症是临床上常见的角膜盲的病因,眼表严重的化学伤及一些免疫性眼表疾病都可导致角膜缘干细胞缺乏,随之眼表血管化、角膜混浊,进而严重影响视力。目前针对角膜缘干细胞缺陷症比较有效的治疗方法是自体/异体角膜缘移植或体外培养的角膜缘干细胞移植。但对双眼角膜缘广泛损伤的患者,缺乏自体角膜缘干细胞来源,而目前临床应用的同种异体角膜移植或角膜缘移植存在着供体筛选、免疫排斥等一系列问题,大大影响治疗效果。成体干细胞横向分化功能的发现,推动了多源化组织工程角膜上皮的构建,有望成为一种新的治疗途径。选择合适的自体种子细胞是目前研究中首要解决的问题。角蛋白K3是角膜上皮特异性表达的蛋白,在口腔黏膜上皮细胞也有表达,且口腔黏膜取材相对隐蔽,愈后不留瘢痕等优点,有望成为组织工程中自体成体干细胞的一个新来源。本研究旨在对组织工程口腔黏膜的种子细胞的培养及生物学特性进行系统研究,探讨最适的种子细胞培养技术,并对组织工程口腔黏膜进行初步研究,为推进未来组织工程黏膜的研究和临床应用打下基础。第一部分兔口腔黏膜上皮细胞（含干细胞）的体外培养目的:探讨口腔黏膜上皮细胞体外培养方法方法:取兔口腔黏膜上皮组织,分别... 

【文章来源】：山西医科大学山西省

【文章页数】：40 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

倒置显微镜上皮细胞培养液中兔口腔

养后期可见少量细胞胞内出现颗粒，增殖缓慢，细胞甚至变圆，脱落死亡(图 1)。第二组中心部位出现复层，细胞呈多角形。（图 2）图1倒置显微镜 上皮细胞培养液中兔口腔 图2 倒置显微镜 Defined K-SFM培养中兔黏膜上皮细胞原代培养 口腔黏膜上皮细胞原代培养口腔粘膜上皮细胞体外培养生长曲线02468101214161 3 5 7 9 11时间（d)0胞数（2×1细4个/ml）系列1系列2细胞生长曲线（表 1）提示：口腔黏膜上皮细胞传代接种后第 1-3d 为静止生长期，细胞贴附，增殖缓慢，第 5-10 d 处于对数生长期，11 d 后进入平台期，细胞出现接触抑制，生长速度减慢。第二组生长速度较第一组快。三、讨 论（一）传统上皮细胞培养体系与无血清培养体系的比较Rheinwald 首创了小鼠成纤维细胞 3T3 作为滋养层和含血清培养液的上皮细胞培养方法。3T3 细胞是 Swiss 鼠胚胎成纤维细胞，3T3 细胞使用前需经射线照射或丝裂霉素 c 处

（一）筛选干细胞的形态观察Ⅳ型胶原黏附纯化后的吸附细胞，胞体较小，形态较圆，饱满，折光性强，胞核大，胞质少，培养2-3天可见大量细胞克隆形成（图3）。图3 倒置显微镜 细胞克隆形成在培养过程中细胞还表现出一定的分化现象，上皮细胞克隆在向外扩张的同时，从克隆中心开始出现分化，细胞表现为复层，出现时间约为接种后5d，克隆表层细胞连接紧密，细胞界限不清，开始时细胞核清晰，随着分层的增加，倒置显微镜下难以分辨单个细胞结构，克隆最外层仍为有增殖能力的单层细胞。（二）筛选干细胞相对特异性蛋白表达盖玻片上培养的经筛选的口腔黏膜上皮细胞免疫细胞化学检测显示胞核绿色荧光着染，即细胞核表达干细胞相对特异性P63蛋白，而阴性对照不着染，细胞核大，胞质较少，呈未成熟细胞特征。蛋白表达和细胞形态两方面均提示所培养细胞为表皮干细胞。（图4）。

【参考文献】：
期刊论文
[1]利用皮肤干细胞的横向分化重建角膜上皮的初步研究[J]. 黄冰,王智崇,葛坚,陈系古,刘敬波,范志刚,陶靖,刘炳乾,郭芬芬.  中华医学杂志. 2004(10)



本文编号：3001741