miRNA-146a调节P.g LPS刺激人牙周膜成纤维细胞成骨分化能力的初步研究

发布时间：2017-04-13 09:17

  本文关键词：miRNA-146a调节P.g LPS刺激人牙周膜成纤维细胞成骨分化能力的初步研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:通过体外培养获得人牙周膜成纤维细胞(Human periodontal ligament cells,HPDLCs),采用microRNA-146a(miR-146a)的模拟物转染,并用牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)对其进行刺激,观察炎性状态下miRNA-146a对人牙周膜成纤维细胞(Human periodontal ligament cells,HPDLCs)成骨分化的影响,并探索其作用机制,从而为牙周炎的治疗、牙槽骨的再生提供更广阔的思路。方法:1.在天津医科大学口腔医院颌面外科选择拔除的健康的双尖牙的患者(年龄12-18岁),经患者知情同意后,收集拔除的双尖牙,PBS反复冲洗,刮取根中1/3牙周膜组织剪碎成1mm3小组织块,采用I型胶原酶+组织块法进行HPDLCs的原代培养,倒置相差显微镜下观察其形态及生长状况。2.检测P.g LPS对HPDLCs成骨分化能力的影响。设对照组、成骨诱导组和1μg/ml P.g LPS+成骨诱导组,7天碱性磷酸酶染色,14天后茜素红染色及茜素红半定量检测;3天、7天和14天后用Real-time PCR检测成骨相关基因的表达。3.检测miRNA-146a对HPDLCs成骨分化能力的影响。设miRNA-146a mimics转染组、negative control组和对照组,用成骨诱导液进行培养,7天行碱性磷酸酶染色和Real-time PCR检测成骨相关基因的表达,14天茜素红染色。4.检测miRNA-146a与P.g LPS共同作用对HPDLCs成骨分化能力的影响。设miRNA-146a mimics+1μg/ml LPS组、negative control+1μg/ml LPS组、1μg/ml LPS组,用成骨诱导液进行培养,7天行碱性磷酸酶染和Real-time PCR检测成骨相关基因的表达,14天茜素红染色。结果:1.倒置显微镜下观察细胞培养至第8-12天,少数长梭形细胞从组织块边缘爬出,并围绕组织块呈放射状排列,传代后细胞生长迅速。2.HPDLCs具有成骨分化的能力。3.P.g LPS刺激下HPDLCs成骨相关基因I型胶原蛋白(collagen 1,COL1)、Runt相关转录因子(runt-related transcription factor 2,RUNX2)、碱性磷酸酶(alkaline phophatase,ALP)和骨钙素(osteocalcin,OCN)的mRNA表达显著降低且具有统计学差异(P0.05),碱性磷酸酶染色及茜素红染色较正常成骨诱导组明显减弱。4.miRNA-146a转染后,碱性磷酸酶及茜素红染色较正常成骨诱导组明显增强,HPDLCs成骨相关基因COL1、RUNX2、、ALP和OCN mRNA的表达显著升高(P0.05)。5.miRNA-146a和P.g LPS共同作用后,碱性磷酸酶染色及茜素红染色较单纯P.g LPS刺激组明显增强,且HPDLCs成骨相关基因COL1、RUNX2、、ALP和OCN mRNA的表达较单纯P.g LPS刺激显著升高,且具有统计学差异(P0.05)。结论:1.P.g LPS抑制HPDLCs成骨分化的能力。2.2.miRNA-146a转染后HPDLCs成骨相关基因的表达显著升高,促进HPDLCs的成骨分化能力。3.miRNA-146a负调节P.g LPS对HPDLCs成骨分化的抑制作用,从而在一定程度上证实在炎症状态下,miRNA-146a的过表达可以有利于牙周组织的修复。
【关键词】：牙龈卟啉单胞菌 脂多糖 牙周炎 人牙周膜成纤维细胞 microRNA-146a
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R781.4
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-11
• 前言11-14
• 研究现状、成果11-12
• 研究目的、方法12-14
• 一、牙龈卟啉单胞菌脂多糖对HPDLCs成骨分化能力的影响14-27
• 1.1 对象和方法14-19
• 1.1.1 主要设备与仪器14-15
• 1.1.2 主要试剂15
• 1.1.3 主要试剂配制15
• 1.1.4 方法15-19
• 1.2 结果19-24
• 1.2.1 HPDLCs的原代培养19
• 1.2.2 HPDLCs的增殖能力19-20
• 1.2.3 P.g LPS刺激后碱性磷酸酶染色的结果20
• 1.2.4 P.g LPS刺激后茜素红染色和茜素红半定量检测的结果20-21
• 1.2.5 P.g LPS刺激后real-time PCR检测成骨相关基因的表达：21-24
• 1.3 讨论24-26
• 1.4 小结26-27
• 二 miRNA-146a对人牙周膜韧带细胞成骨分化能力的影响27-35
• 2.1 对象和方法27-28
• 2.1.1 主要设备与仪器27
• 2.1.2 主要试剂27
• 2.1.3 分组27
• 2.1.4 miRNA转染27-28
• 2.1.5 MTT法检测microRNA-146a转染后HPDLSCs的增殖能力28
• 2.1.6 碱性磷酸酶染色28
• 2.1.7 茜素红染色及茜素红半定量检测的结果28
• 2.1.8 Real-time PCR检测成骨相关基因的mRNA表达28
• 2.2 结果28-32
• 2.2.1 miRNA-146a对HPDLCs增殖能力的影响28-29
• 2.2.2 碱性磷酸酶染色和茜素红染色已经茜素红半定量检测29-31
• 2.2.3 miRNA-146a转染后real-time PCR检测成骨相关基因的表达水平31-32
• 2.3 讨论32-34
• 2.4 小结34-35
• 三、miRNA-146a对P.g LPS刺激人牙周膜韧带细胞成骨分化能力的影响35-43
• 3.1 对象和方法35-36
• 3.1.1 主要设备与仪器35
• 3.1.2 主要试剂35
• 3.1.3 分组35
• 3.1.4 microRNA转染35
• 3.1.5 MTT法检测miRNA-146a和P.g LPS共同作用后HPDLSCs的增殖能力35
• 3.1.6 碱性磷酸酶和茜素红染色35
• 3.1.7 Real-time PCR检测成骨相关基因的mRNA表达35-36
• 3.2 结果36-41
• 3.2.1 miRNA-146a和P.g LPS对HPDLCs增殖能力的影响36
• 3.2.2 碱性磷酸酶和茜素红染色36-38
• 3.2.3 real-time PCR检测miRNA-146a和P.g LPS共同作用后成骨相关基因的表达水平38-41
• 3.3 讨论41-42
• 3.4 小结42-43
• 结论43-44
• 参考文献44-48
• 发表论文和参加科研情况48-49
• 综述 Micro RNA调节干细胞成骨及成软骨分化的研究进展49-59
• 综述参考文献55-59
• 致谢59

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 王祥;张斌;关呈超;姜竹玲;姜瑛;;提高人牙周膜成纤维细胞体外培养成功率的方法总结[J];现代口腔医学杂志;2011年06期

2 黄美香;闫福华;姚丽艳;李大兰;郑瑜谦;李艳芬;林敏魁;;环孢素A联合脂多糖对牙周膜成纤维细胞增殖的影响[J];中华口腔医学研究杂志(电子版);2011年05期

  本文关键词：miRNA-146a调节P.g LPS刺激人牙周膜成纤维细胞成骨分化能力的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：303278