牙龈卟啉单胞菌蛋白酶Ltp1的表达与纯化

发布时间：2021-03-20 19:29

　　牙龈卟啉单胞菌是牙周病,尤其是慢性牙周炎病变区最主要的优势细菌,是目前公认的牙周病致病菌。其毒力因子主要包括外膜上的纤毛、脂多糖、外膜膜泡,多种胞外蛋白酶、内毒素、磷酸酶等。而酪氨酸蛋白酶（Tyrosine protein phosphatase,Ltp1）被鉴定为主要的毒力因子之一,但是其致病机制未知。目的:构建牙龈卟啉单胞菌中Ltp1基因的原核表达系统,表达和纯化目的蛋白Ltp1,同时对目的蛋白进行晶体学初筛,尝试优化蛋白晶体,并通过X射线晶体衍射的方法解析结构,基于结构阐明Ltp1的生物学功能和致病机理。材料与方法:直接合成Ltp1目的基因片段,然后通过重组法,将目的基因片段构建于带有组氨酸（His）标签的p ET29质粒载体上,转化至大肠杆菌E.coli BL21（DE3）感受态中,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导感受态过表达目的蛋白Ltp1,然后以镍柱亲和层析和分子筛对目的蛋白进行纯化,通过免疫印迹法分析鉴定其免疫原性;利用硝基苯磷酸盐（p-Nitrophenyl phosphate,... 

【文章来源】：安徽医科大学安徽省

【文章页数】：62 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

pET-29a表达载体图谱

安徽医科大学硕士学位论文pET-29a-c(+)载体携带N端STag/凝血酶构型和可选的C端HisTag序列。环状序列质粒图谱上显示其独特的位点。注意，该序列是按pBR322质粒的编码规则进行编号的，因此T7蛋白表达区在质粒图谱上是反序的。由T7RNA聚合酶启动的克隆和表达区如上图所示。而且F1复制子是定向的，因此在T7噬菌体聚合酶（T7启动子）作用下，包括：蛋白序列编码病毒粒子的产生，以启动蛋白表达；而终止则是由T7终止子完成图2-2pET-29a序列标志Fig2-2pET-29asequencelandmarks表达菌株：大肠杆菌E.coliBL21(DE3）2.1.2实验试剂与溶液（1）引物合成：根据Genebank上查询所得目的基因片段，对其进行优化，同时设计引物（均是通过软件PrimerPremier5辅助完成的），完成后发送给安徽通用系统生物有限公司进行合成。（目的基因该公司直接构建在了其公司默认使用的pET19-b载体上）引物：上游引物pg1641-S：5’-AGGAGATATACATATGAAGCCGCATAAAATTCTGTT-3’；下游引物pg1641-A：5’-GGTGGTGGTGCTCGAGATCGCAGGCGCTCAGACTAC-3’。

安徽医科大学硕士学位论文图1pg1641菌液PCR后DNA琼脂糖凝胶电泳Fig1DNAagarosegelelectrophoresisofpg1641afterPCRM：DNAMarker；1、2、3、4、5、6：菌液PCR后目的基因pg1641图2测序结果对比Fig2Comparisonofsequencingresults

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3091542