Sedlin与RB1相互作用的机制研究

发布时间：2021-04-19 04:55

　　目的 构建脊椎骨骺发育不良蛋白Sedlin的缺失突变体和点突变体质粒,检测其在细胞内的表达、定位及其与RB1蛋白的共定位情况,并在此基础上进行了Sedlin突变体与RB1突变体相互作用研究,以及通过RNA干扰（siRNA和shRN A）技术探索Sedlin在哺乳动物细胞中的功能,及其对RB1参与细胞周期调控的影响。方法 以Sedlin全长cDNA序列为模板,扩增目的基因序列,连接至表达载体,构建3个原核表达质粒,即pGEX-3X-SedlinN/Y115A/Y115F和相应的真核表达质粒,即pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F。分别单转pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F以及将上述质粒分别与pDNA3.1-FLAG-RB1/-N/-C共转到COS7细胞中,免疫荧光制片,观察其在真核细胞内的定位及共定位情况;制备GST-SedlinN融合蛋白,转染pDNA3.1-FLAG-RB1-N质粒至HEK 293T细胞,进行GST pulldown实验,探究二者在细胞外的相互作用情况;在HEK 293T细胞中共转pCDGFP-SedlinN和pDNA3.1-FLAG... 

【文章来源】：安徽医科大学安徽省

【文章页数】：61 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

重组质粒的酶切鉴定图

图 2 Sedlin 及其突变体蛋白在 COS7 细胞中的定位DAPI：细胞核； MERGE：叠加效果ig. 2 Localization of Sedlin and its mutant proteins in COS7 cellsDAPI indicates nucleus.蛋白与 RB1 突变体蛋白（RB1/-N/-C）的共定位研究在之前的研究已经证明 Sedlin 与 RB1 的 N 端和 C 端均存在光共聚焦技术进一步验证了此结果，见图 3。

图 3 Sedlin 蛋白与 RB1 突变体蛋白（RB1-N/-C）在 COS7 细胞中的共定位DAPI：细胞核； MERGE：叠加效果olocalization of Sedlin protein and RB1 mutant proteins（RB1-N/-C）in COS7 cellDAPI indicates nucleus.edlin 突变体蛋白（Sedlin-N）与 RB1 突变体蛋白（RB1/-N/-C）的共定位Sedlin 与 RB1 的 N 端和 C 端均存在共定位的基础上，我们分别共转了 S体质粒 pcDGFP-SedlinN 与 pcDNA3.1-FLAG-RB1/-N/-C 至 COS7 细胞中荧光制片并且通过激光共聚焦显微镜拍摄，结果显示，SedlinN 蛋白与 白在核内均存在明显的共定位，但与 RB1-N 蛋白不存在共定位，见图 4dlin 的 C 端缺失并不影响其与 RB1 的共定位，提示 Sedlin 的 N 端可能是 相互结合的重要结构域。

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3146876