粘附素及其他致病相关因子在中间普氏菌与人上皮细胞互作中的作用研究

发布时间：2021-04-19 14:52

　　牙周病是常见的口腔疾病,在世界范围内有很高的发病率。中间普氏菌（Prevotella intermedia）是一种与牙周病相关的病原菌,在牙周病的发生和发展中起到重要的作用。中间普氏菌能粘附和侵入多种宿主细胞,在这一过程中细菌粘附素及其他致病相关因子起了很重要的作用。目前该过程的分子机制以及所参与蛋白的功能仍有待进一步的研究。本论文利用中间普氏菌17全基因组序列,应用生物信息学、基因组学和蛋白组学方法来研究中间普氏菌与人上皮细胞相互作用过程中相关基因和蛋白的功能及其机制。生物信息学研究中间普氏菌全基因组序列发现其具有两个富含亮氨酸重复序列的潜在粘附素,AdpD和AdpE.分别把编码这两个蛋白的基因PI1564和PI1571克隆到pET30a（+）原核表达载体上,并将重组的表达载体转化进入大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中诱导AdpD和AdpE融合蛋白的表达。酶联免疫吸附（ELISA）分析表明AdpD特异结合纤维蛋白原,而AdpE特异结合胶原蛋白。Western印迹表明AdpD和AdpE分布在中间普氏菌细胞外膜上。额外加入的融合蛋白AdpD和AdpE能抑制中间普氏菌粘附到口腔上皮细胞H... 

【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：180 页

【学位级别】：博士

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致谢
摘要
Abstract
目录
图目录
表目录
缩略语表
1 文献综述
    1.1 牙周病
    1.2 口腔细菌
        1.2.1 口腔微生物环境
        1.2.2 口腔细菌种类及其生境
        1.2.3 牙菌斑
        1.2.4 牙周病原菌
        1.2.5 细菌分泌的致病相关因子
    1.3 口腔细菌与宿主的相互关系
        1.3.1 动态平衡关系
        1.3.2 牙周病原菌侵入宿主的机制
        1.3.3 细菌外膜蛋白
    1.4 口腔细菌的粘附机制
        1.4.1 研究口腔细菌粘附机制的有利条件
        1.4.2 口腔细菌粘附机制的研究进展
        1.4.3 粘附机制概述
        1.4.4 细菌组成变化
        1.4.5 龈下细菌及细菌共聚
        1.4.6 唾液蛋白和膜上受体
        1.4.7 粘附素
    1.5 中间普氏菌
2 中间普氏菌中一个能结合纤维蛋白原的蛋白AdpD的鉴定
    2.1 材料与方法
        2.1.1 试剂和仪器
        2.1.2 菌株和质粒载体
        2.1.3 真核细胞的培养
        2.1.4 细菌总DNA提取
        2.1.5 细菌外膜蛋白基因的克隆
        2.1.6 基因原核表达载体的构建
        2.1.7 蛋白质的原核表达及表达产物的纯化
        2.1.8 SDS-PAGE蛋白电泳
        2.1.9 Western印迹分析
        2.1.10 蛋白定量
        2.1.11 多抗血清的制备及纯化
        2.1.12 酶联免疫吸附法
TM Nickel-HRP检测His标签的融合蛋白">        2.1.13 HisDetector^TM Nickel-HRP检测His标签的融合蛋白
        2.1.14 细菌外膜蛋白制备
        2.1.15 检测真核细胞中的纤维蛋白原
        2.1.16 细菌与上皮细胞粘附实验
    2.2 结果分析
        2.2.1 AdpD是一个富亮氨酸的BspA类蛋白
        2.2.2 adpD基因的克隆和原核表达载体构建
        2.2.3 利用pET30a（+）载体在大肠杆菌中表达His融合蛋白
        2.2.4 融合蛋白rAdpD的纯化
        2.2.5 针对AdpD蛋白的特异性抗体的制备
        2.2.6 AdpD是一个纤维蛋白原结合蛋白
        2.2.7 AdpD是一个外膜蛋白
        2.2.8 纤维蛋白原在宿主细胞中的分布
        2.2.9 AdpD对中间普氏菌粘附口腔上皮细胞的促进作用
    2.3 讨论
3 中间普氏菌中一个能结合胶原蛋白的蛋白AdpE的鉴定
    3.1 材料与方法
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 细菌外膜蛋白基因的克隆
        3.1.3 原核表达载体的构建和蛋白原核表达
        3.1.4 多抗血清的制备及纯化
        3.1.5 SDS-PAGE蛋白电泳和Western印迹分析
TM Nickel-HRP检测His标签的融合蛋白">        3.1.6 HisDetector^TM Nickel-HRP检测His标签的融合蛋白
        3.1.7 细菌与上皮细胞粘附实验
    3.2 结果分析
        3.2.1 AdpE是一个富亮氨酸的BspA类蛋白
        3.2.2 AdpE的原核表达及纯化
        3.2.3 针对AdpE蛋白的特异性抗体的制备
        3.2.4 AdpE是一个胶原蛋白结合蛋白
        3.2.5 AdpE是一个细菌外膜蛋白
        3.2.6 AdpE对中间普氏菌粘附口腔上皮细胞的促进作用
    3.3 讨论
4 应用qRT-PCR阵列对中间普氏菌与HeLa细胞相互作用后粘附素基因表达水平的研究
    4.1 材料与方法
        4.1.1 试剂和仪器
        4.1.2 菌株和真核细胞培养
        4.1.3 侵入实验及样品制备
        4.1.4 RNA的提取
        4.1.5 cDNA的合成
        4.1.6 qRT-PCR
        4.1.7 数据分析方法
        4.1.8 差异表达基因的克隆和蛋白特性分析
    4.2 结果分析
        4.2.1 实验体系的验证
        4.2.2 PCR扩增效率和引物特异性的分析
        4.2.3 中间普氏菌与HeLa细胞相互作用后的基因表达
        4.2.4 中间普氏菌生长在条件培养液中的基因表达
        4.2.5 基因PIO137生物学功能鉴定
    4.3 讨论
5 中间普氏菌针对HN4和HeLa细胞分泌因子的蛋白表达差异研究
    5.1 材料与方法
        5.1.1 试剂和仪器
        5.1.2 在细胞条件培养液中培养细菌
        5.1.3 细菌外膜蛋白的荧光染色和样品制备
        5.1.4 细菌全蛋白的提取和制备
        5.1.5 蛋白质浓度测定
        5.1.6 等电聚焦
        5.1.7 胶条平衡
        5.1.8 第二维SDS-PAGE电泳
        5.1.9 凝胶染色及图像分析
        5.1.10 液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析
        5.1.11 qRT-PCR检测差异蛋白对应的转录水平
    5.2 结果分析
        5.2.1 中间普氏菌外膜蛋白的二维凝胶电泳图谱
        5.2.2 外膜蛋白质谱检测
        5.2.3 编码差异蛋白基因的转录水平
        5.2.4 中间普氏菌全蛋白的二维凝胶电泳图谱
    5.3 讨论
        5.3.1 二维凝胶电泳实验优化
        5.3.2 差异蛋白分析
6 全文小结
参考文献
附7 不同牙周健康状况者四种牙周病原菌的检测水平
    7.1 材料与方法
        7.1.1 技术方案
        7.1.2 实验材料和仪器
        7.1.3 纳入标准
        7.1.4 临床检查和牙周样品采集
        7.1.5 DNA提取
        7.1.6 实时荧光定量PCR反应
        7.1.7 标准定量曲线制备
        7.1.8 统计分析
    7.2 结果分析
        7.2.1 检测条件
        7.2.2 不同牙周状况者四种牙周病原菌的检出率
        7.2.3 在不同牙周状况者四种牙周细菌的分布数量
        7.2.4 细菌在唾液、龈上菌斑和龈下菌斑不同部位分布的相关性
        7.2.5 四种细菌之间在不同口腔部位分布的相关性
    7.3 讨论
    第7章 参考文献
附表
作者简历



本文编号：3147764