牙本质非胶原蛋白对大鼠骨髓间充质干细胞牙/骨向分化能力影响的研究
发布时间：2021-08-13 08:26
研究目的：明确牙本质非胶原蛋白（dentin non-collagenous proteins,DNCPs）对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMMSCs）增殖及牙/骨向分化能力的影响，为牙髓组织再生研究及牙髓治疗由传统物理充填治疗向生物学治疗提供实验依据。研究方法：通过全骨髓贴壁法获取大鼠BMMSCs并对其组织来源进行鉴定，取第35代细胞用于后续实验。体外实验：采用MTT法及碱性磷酸酶活性测定确定DNCPs的最佳作用浓度，并绘制生长曲线，计算群体倍增时间；流式细胞术检测细胞增殖周期计算增殖指数（PI）。采用碱性磷酸酶活性检测、茜素红染色法、实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹检测DNCPs对大鼠BMMSCs的增殖和牙/骨向分化能力的影响。体内实验：以1×106密度收集DNCPs诱导7d后及未诱导的BMMSCs分别与羟基磷灰石复合后移植到大鼠的肾被膜下，3W后取材、固定、脱矿、包埋、连续切片，进行HE染色观察移植物的组织形态，并通过偏振光显微镜观察形成组织的纤维排列方向。实验结果：培养的大鼠B...
【文章来源】：南京医科大学江苏省
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
全骨髓贴壁法培养的BMMSCs形态学、免疫细胞化学观察A：BMMSCs抗VIM染色阳性，胞质呈现出褐色强染色；B：BMMSCs抗CK染色阴性，胞质未见黄色染色；C：PBS对照无着色，胞质无黄色染色；D：BMMSCs
图 1.2 BMMSCs 的增殖状况及细胞周期分布A：BMMSCs 在接种后第 3 d 左右进入对数生长期，第 7 d 左右进入平台期，整体生长曲线呈“S”形，PDT 为 48.5±2.8 h；B：BMMSCs FCM 分析细胞周期分布，G0/G1期、S 期及 G2/M 期比例分别为 74.09%、21.25%及 4.66%，BMMSCs的增殖指数（G2/M+S）为 25.91%。3 讨论由于BMMSCs在骨髓中的含量不高，很难满足实际应用需要，因此，建立稳定的BMMSCs培养体系，对其进行体外的大量扩增成为首先面对的问题。目前常用的BMMSCs的分离培养方法有全骨髓贴壁法，密度梯度离心法，流式细胞仪筛选及免疫磁珠筛选等。本实验利用操作相对简单的全骨髓贴壁法获取BMMSCs，所得细胞具备间充质来源干细胞的特征。首先是骨髓来源。因为细胞采用的是全骨髓贴壁法，所以细胞来源于骨髓无可厚非，且通过免疫细胞化学染色发现所培养的细胞角蛋白染色阴性，波形
图 2.1 DNCPs 最佳作用浓度的确定A：DNCPs 以浓度为 0、0.1、1、10、100 μg/mL 作用于细胞 3 d 后，MTT 法检测不同浓度 DNCPs 对细胞增殖能力的影响，在浓度为 0.1 ~ 10 μg/mL 时，DNCPs对 BMMSCs 的增殖能力无明显的促进作用，数值虽依次上升，并无显著性差异（P>0.05），在 100 μg/mL 时相对 Control 组增殖能力下降，统计学无显著性差异（P>0.05）；B：ALP 活性在 DNCPs 浓度为 0.1、1 μg/mL 时，相对 Control 组无显著性差异（P>0.05），DNCPs 浓度为 10、100 μg/mL 时，相对 Control 组明显增高，差异有统计学意义（P<0.01），其中 100 μg/mL 组低于 10 μg/mL 组，无显著性差异（P>0.05）。因此，10 μg/mL 为 DNCPs 最佳作用浓度，以此浓度作用于后续实验。
本文编号：3340092
【文章来源】：南京医科大学江苏省
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
全骨髓贴壁法培养的BMMSCs形态学、免疫细胞化学观察A：BMMSCs抗VIM染色阳性，胞质呈现出褐色强染色；B：BMMSCs抗CK染色阴性，胞质未见黄色染色；C：PBS对照无着色，胞质无黄色染色；D：BMMSCs
图 1.2 BMMSCs 的增殖状况及细胞周期分布A：BMMSCs 在接种后第 3 d 左右进入对数生长期，第 7 d 左右进入平台期，整体生长曲线呈“S”形，PDT 为 48.5±2.8 h；B：BMMSCs FCM 分析细胞周期分布，G0/G1期、S 期及 G2/M 期比例分别为 74.09%、21.25%及 4.66%，BMMSCs的增殖指数（G2/M+S）为 25.91%。3 讨论由于BMMSCs在骨髓中的含量不高，很难满足实际应用需要，因此，建立稳定的BMMSCs培养体系，对其进行体外的大量扩增成为首先面对的问题。目前常用的BMMSCs的分离培养方法有全骨髓贴壁法，密度梯度离心法，流式细胞仪筛选及免疫磁珠筛选等。本实验利用操作相对简单的全骨髓贴壁法获取BMMSCs，所得细胞具备间充质来源干细胞的特征。首先是骨髓来源。因为细胞采用的是全骨髓贴壁法，所以细胞来源于骨髓无可厚非，且通过免疫细胞化学染色发现所培养的细胞角蛋白染色阴性，波形
图 2.1 DNCPs 最佳作用浓度的确定A：DNCPs 以浓度为 0、0.1、1、10、100 μg/mL 作用于细胞 3 d 后，MTT 法检测不同浓度 DNCPs 对细胞增殖能力的影响，在浓度为 0.1 ~ 10 μg/mL 时，DNCPs对 BMMSCs 的增殖能力无明显的促进作用，数值虽依次上升，并无显著性差异（P>0.05），在 100 μg/mL 时相对 Control 组增殖能力下降，统计学无显著性差异（P>0.05）；B：ALP 活性在 DNCPs 浓度为 0.1、1 μg/mL 时，相对 Control 组无显著性差异（P>0.05），DNCPs 浓度为 10、100 μg/mL 时，相对 Control 组明显增高，差异有统计学意义（P<0.01），其中 100 μg/mL 组低于 10 μg/mL 组，无显著性差异（P>0.05）。因此，10 μg/mL 为 DNCPs 最佳作用浓度，以此浓度作用于后续实验。
本文编号：3340092
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/kouq/3340092.html
最近更新
教材专著
