人釉原蛋白及其功能片段LRAP和TRAP的提取和表达

发布时间：2017-05-06 12:06

  本文关键词：人釉原蛋白及其功能片段LRAP和TRAP的提取和表达，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:提取人釉原蛋白全长及其功能片段LRAP和TRAP,并在原核生物内表达和重建。方法:本研究包括以下两个部分:实验一:从处于釉质发育阶段的人下颌第三磨牙的牙胚中取得总RNA,通过RT-PCR得到釉原蛋白全长基因,与pMD19-T载体构建质粒后转入大肠杆菌E.coliTop10中扩增,将阳性菌测序以鉴定为正确的釉原蛋白全长作模板,重叠延伸PCR构建LRAP、扩增TRAP基因,克隆后测序鉴定获得的LRAP及TRAP。实验二:釉原蛋白全长基因及LRAP和TRAP分别与原核表达载体pET-28a(+)行质粒构建,将重组质粒进行筛选和鉴定后在大肠杆菌E.coli BL21plys中用IPTG诱导表达,纯化表达蛋白后用变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证。由于LRAP及TRAP基因未表达,另将LRAP及TRAP基因分别与pCold-SUMO原核表达载体进行质粒构建,测序鉴定后于BL21(DE3)Chaprone宿主菌中诱导表达,并用rTEV蛋白酶切,Ni-NTA Resin纯化,后以SDS-PAGE验证。结果:对釉原蛋白基因与pMD19-T载体构建的质粒进行测序后比对分析,结果与NCBI公布的序列一致,表明获得了釉原蛋白全长基因。通过重叠延伸PCR获得的LRAP片段及扩增的TRAP片段经克隆并测序鉴定,结果与分析片段序列一致,表明获得了LRAP及TRAP基因。分别将测序鉴定正确的pET-28a(+)-Am、pET-28a(+)-LRAP和pET-28a(+)-TRAP质粒在大肠杆菌E.coli中诱导表达并纯化后进行SDS-PAGE检验,结果显示釉原蛋白在大肠杆菌E.coliBL21plys中诱导表达了22kDa左右的蛋白,而LRAP及TRAP均未表达。分别将测序鉴定正确的pCold-SUMO-LRAP和pCold-SUMO-TRAP在BL21(DE3)Chaprone宿主菌内表达、酶切、纯化和SDS-PAGE检测,结果示功能片段LRAP及TRAP均在BL21(DE3)Chaprone中诱导表达了5-6kDa左右的蛋白。结论:可通过处于釉质发育阶段的人下颌第三磨牙牙胚获得的细胞总RNA克隆人釉原蛋白及其功能片段LRAP与TRAP。人釉原蛋白全长及其功能片段LRAP与TRAP均可在原核生物中诱导表达蛋白。
【关键词】：釉原蛋白 LRAP TRAP 基因克隆 基因测序 蛋白表达
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R781
【目录】：

• 中英文缩略词表4-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-13
• 实验一 人釉原蛋白全长及其功能片段 LRAP 与 TRAP 的提取、13-31
• 1 材料13-16
• 2 方法16-26
• 3 结果26-30
• 4 小结30-31
• 实验二 釉原蛋白全长及功能片段 LRAP、TRAP 的原核表达研究31-49
• 1 材料31-34
• 2 方法34-42
• 3 结果42-44
• 4 讨论44-48
• 5 结论48-49
• 参考文献49-51
• 综述：人釉原蛋白的研究进展51-63
• 参考文献59-63
• 致谢63-64
• 作者简介64-65

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 孙樱林;冯海兰;黄薇;;重组釉原蛋白的提取和纯化[J];口腔颌面修复学杂志;2010年02期

2 陶洪;王琳;侯铁舟;张珑;王雪绒;;氟对小鼠釉原蛋白基因表达的影响[J];西安交通大学学报(医学版);2010年06期

3 余擎,吴补领;釉原蛋白的分子生物学研究进展[J];牙体牙髓牙周病学杂志;1999年04期

4 郝建军,刘正,费俭,史俊南;釉原蛋白基因的分子生物学[J];牙体牙髓牙周病学杂志;1999年04期

5 徐琛蓉,杨爱玲,章锦才广东省口腔医院口腔内科 ,殷春一,张蕴惠,张静仪;猪发育期牙胚釉原蛋白的分离纯化及其多克隆抗体的制备[J];华西口腔医学杂志;2003年02期

6 隋文,洪咏龙,肖明振,Tim W;大鼠牙胚发育过程中釉原蛋白含量在空间和时间上的变化[J];中国现代医学杂志;2003年07期

7 李希庭;束蓉;;釉原蛋白在牙周组织表达及功能的研究进展[J];口腔医学研究;2009年05期

8 隋文,肖明振,洪泳龙,陈新梅;大鼠牙胚发育过程中釉原蛋白的表达[J];牙体牙髓牙周病学杂志;2001年04期

9 林智恺;束蓉;程岚;宋忠臣;郭秋曼;张秀丽;;重组全长人釉原蛋白对人成纤维细胞黏附、增殖、迁移的影响[J];上海口腔医学;2013年01期

10 倪雪岩,欧阳喈,高野吉郎,孙宏晨;环磷酰胺作用下釉原蛋白在大鼠牙髓及牙髓内新生硬组织中的表达[J];口腔医学研究;2003年05期

中国重要会议论文全文数据库 前4条

1 田华;吕平;周春燕;高学军;;小鼠牙胚发育过程中釉原蛋白和釉蛋白的表达特征[A];全国第八次牙体牙髓病学学术会议论文汇编[C];2011年

2 倪雪岩;吕亚林;高野吉郎;;环磷酰胺作用下大鼠切牙釉原蛋白向牙髓侧扩散及诱导硬组织新生:釉基质蛋白硬组织诱导功能研究[A];2007年第七次全国牙体牙髓病学学术会议论文集[C];2007年

3 孔莉;孙中安;戴冬梅;;釉原蛋白壳聚糖敷料用于糖尿病足护理的临床效果[A];全国内科护理学术交流暨专题讲座会议、全国心脏内、外科护理学术交流暨专题讲座会议、全国第8届糖尿病护理学术交流暨专题讲座会议、全国第8届血液净化护理学术交流暨专题讲座会议论文汇编[C];2010年

4 林智恺;束蓉;宋忠臣;程岚;;重组全长人釉原蛋白调节NF-κB信号通路对促进人骨髓基质细胞成骨的影响[A];第十次全国牙周病学学术会议论文摘要汇编[C];2014年

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 姚乃晖;釉原蛋白对MDPC-23细胞分化影响的实验研究[D];第三军医大学;2011年

2 隋文;釉原蛋白基因cDNA克隆、蛋白表达、纯化、探针与抗体制备及相关功能研究[D];第四军医大学;2000年

中国硕士学位论文全文数据库 前5条

1 姚静;人釉原蛋白及其功能片段LRAP和TRAP的提取和表达[D];遵义医学院;2016年

2 张艺文;低分子量釉原蛋白的纯化及其对牙源性间充质来源细胞作用的实验研究[D];第四军医大学;2009年

3 王培欢;西安地区出土3000年前人釉原蛋白基因的分析[D];第四军医大学;2011年

4 宁天云;类釉原蛋白两亲性寡肽诱导脱矿釉质的仿生矿化研究[D];南京医科大学;2012年

5 罗菁菁;牙釉质仿生矿化的研究[D];安徽医科大学;2012年

  本文关键词：人釉原蛋白及其功能片段LRAP和TRAP的提取和表达，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：348355