凋亡蛋白抑制因子5在牙周炎中的作用和机制的初步探索

发布时间：2017-08-08 01:02

  本文关键词：凋亡蛋白抑制因子5在牙周炎中的作用和机制的初步探索

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【摘要】：目的:本研究旨在通过体外细胞实验比较健康人及慢性牙周炎患者的健康牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs)的细胞活性及细胞凋亡相关基因的差异,分析两种不同来源的牙龈组织中凋亡蛋白抑制因子5(apoptosis protein inhibitor 5,API5)及细胞凋亡相关因子的变化,siRNA技术检测API5对HGFs细胞活性和凋亡的影响,以及探索其可能的调节机制,为阐明牙周炎的发病机制以及探索新的治疗方法提供实验依据。方法:1.经患者知情同意后,收集健康人及慢性牙周炎患者在拔除埋伏阻生的第三磨牙时健康牙龈组织,立即置入含有100U双抗的PBS液中反复冲洗,将牙龈组织剪成约1mm3的小块,采用组织块贴壁法体外培养HGFs,倒置相差显微镜观察细胞形态及生长状况。2.健康人及慢性牙周炎HGFs体外培养不同时间后检测其细胞活性;体外培养2d、4d后实时荧光定量PCR(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)检测B细胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)的表达及分析两者的比值变化。3.经患者知情同意后,收集健康人及慢性牙周炎患者的牙龈组织,立即置入含有RNAlater保存液的EP管中,采用Trizol法提取组织总RNA,按试剂盒操作反转录合成cDNA。对从总RNA中提取的cDNA进行real-time PCR,检测细胞凋亡相关因子API5、Bcl-2、Bax、B细胞淋巴瘤-xl(B-cell lymphoma-extra large,Bcl-xl)、细胞周期蛋白E 1(cyclin E1,CCNE1)的mRNA表达水平。4.siRNA API5转染健康人HGFs,提取细胞总蛋白进行蛋白免疫印迹实验,检测siRNA API5的转染效率。5.siRNA API5转染细胞后采用MTT和流式细胞仪检测siRNA API5对细胞活性、细胞凋亡的影响。设空白对照组、阴性对照、siRNA API5组。6.siRNA API5转染细胞后采用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-PCR,RT-PCR)检测HGFs中API5对凋亡相关基因表达的影响。设空白对照组、阴性对照、siRNA API5组。结果:1.采用组织块贴壁法,健康组和慢性牙周炎组均成功培养出HGFs,传代后细胞趋于一致的长梭形并呈放射状排列,生长旺盛。慢性牙周炎组HGFs细胞活性低于健康组,在细胞培养第4d、6d、8d时细胞活性明显降低(P0.05),细胞凋亡增强。2.在细胞培养2d后,与健康组对比,慢性牙周炎组HGFs中Bax的mRNA水平升高,但Bcl-2的mRNA水平在两组间无差别,慢性牙周炎组Bcl-2/Bax的比值较健康组降低(P0.05)。在细胞培养4d后,慢性牙周炎组HGFs中Bcl-2和Bax的mRNA水平均高于健康组,但Bax的mRNA水平升高更明显,Bcl-2/Bax的比值明显低于健康组(P0.05)。3.慢性牙周炎组牙龈组织中API5、Bcl-2的mRNA表达水平低于健康组(P0.05),Bcl-xl的mRNA表达虽然有下降趋势,但无统计学意义(P0.05);Bax、CCNE1在慢性牙周炎组牙龈组织中的表达高于健康组(P0.05)。4.蛋白免疫印迹实验结果表明siRNA API5成功转染至HGFs,抑制效率49.54%。siRNA API5转染后,HGFs细胞活性明显减低,细胞凋亡增加(P0.05)。siRNA API5转染HGFs后,在第0d、1d、3d时,API5、Bcl-2以及CCNE1的表达明显低于对照组(P0.05),Bcl-xl的表达在第3d时明显下降(P0.05),但在第0d、1d无统计学差异(P0.05),Bax的表达显著高于对照组(P0.05),Bcl-2/Bax的比值明显低于对照组(P0.05)。结论:1.与健康人相比,慢性牙周炎患者HGFs的细胞活性降低,细胞凋亡增加,说明慢性牙周炎患者自身牙周组织修复能力差,具有牙周炎易感性。2.抑制API5导致HGFs细胞活性降低,细胞凋亡增加,而且在慢性牙周炎牙龈组织中API5表达下降,说明API5参与牙周炎发病的细胞凋亡机制。3.抑制API5可以降低HGFs中Bcl-2、Bcl-xl以及CCNE1的表达,升高Bax的表达,同时下调Bcl-2/Bax的比值,说明API5通过调节细胞凋亡相关因子的表达,参与慢性牙周炎的发生发展过程。
【关键词】：牙周炎 细胞凋亡 凋亡蛋白抑制因子5 B细胞淋巴瘤-2 Bcl-2相关X蛋白 B细胞淋巴瘤-xl 细胞周期蛋白E1
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R781.42
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 缩略语/符号说明12-13
• 前言13-16
• 研究现状、成果13-14
• 研究目的、方法14-16
• 一、慢性牙周炎患者和健康人牙龈成纤维细胞细胞活性和凋亡相关因子Bcl-2、Bax的比较16-26
• 1.1 对象和方法16-21
• 1.1.1 主要设备和仪器16-17
• 1.1.2 主要试剂17
• 1.1.3 主要试剂的配制17-18
• 1.1.4 研究对象和方法18-21
• 1.2 结果21-23
• 1.2.1 人牙龈成纤维细胞的原代培养21
• 1.2.2 健康组与慢性牙周炎组HGFs细胞活性的比较21-22
• 1.2.3 健康组与慢性牙周炎组HGFs中凋亡相关因子的比较22-23
• 1.3 讨论23-25
• 1.4 小结25-26
• 二、健康人及慢性牙周炎患者牙龈组织中API5及其他凋亡相关因子的差异性比较26-35
• 2.1 对象和方法26-29
• 2.1.1 主要设备和仪器26-27
• 2.1.2 主要试剂27
• 2.1.3 研究对象和方法27-29
• 2.2 结果29-30
• 2.2.1 各组间年龄、性别统计学分析29
• 2.2.2 real-time PCR检测API5及其他凋亡相关因子的表达29-30
• 2.3 讨论30-34
• 2.4 小结34-35
• 三、抑制API5对人牙龈成纤维细胞细胞活性及凋亡的影响35-44
• 3.1 对象和方法35-40
• 3.1.1 主要设备和仪器35-36
• 3.1.2 主要实验试剂36
• 3.1.3 主要试剂的配制36-37
• 3.1.4 实验分组37
• 3.1.5 细胞蛋白提取和蛋白质免疫印迹实验37-39
• 3.1.6 MTT检测siRNA API5转染后HGFs的细胞活性39
• 3.1.7 流式细胞仪检测siRNA API5转染后HGFs的细胞凋亡39-40
• 3.1.8 统计学分析40
• 3.2 结果40-41
• 3.2.1 蛋白免疫印迹检测API5的表达40
• 3.2.2 siRNA API5转染后对HGFs细胞活性的影响40-41
• 3.2.3 siRNA API5转染后对HGFs细胞凋亡的影响41
• 3.3 讨论41-43
• 3.4 小结43-44
• 四、抑制API5对人牙龈成纤维细胞中细胞凋亡相关因子的影响44-52
• 4.1 对象和方法44-46
• 4.1.1 主要设备和仪器44-45
• 4.1.2 主要实验试剂45
• 4.1.3 主要试剂的制备45
• 4.1.4 实验分组45
• 4.1.5 RT-PCR半定量检测凋亡相关因子的表达45-46
• 4.1.6 统计学分析46
• 4.2 结果46-49
• 4.2.1 RT-PCR半定量检测凋亡相关基因的表达46-49
• 4.3 讨论49-51
• 4.4 小结51-52
• 结论52-53
• 参考文献53-59
• 发表论文和参加科研情况说明59-60
• 综述 凋亡抑制因子5与细胞凋亡关系的研究进展60-66
• 综述参考文献64-66
• 致谢66

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本文编号：637496