新型高效靶向ROS响应的载药纳米粒子系统在口腔鳞癌治疗中的研究

发布时间：2017-08-16 04:05

  本文关键词：新型高效靶向ROS响应的载药纳米粒子系统在口腔鳞癌治疗中的研究

  更多相关文章： 纳米粒子 ROS响应 靶向 口腔鳞癌

【摘要】：目的：口腔鳞癌(OSCC)是一种常见的口腔肿瘤,在过去的20年中,人们在oscc的预防、诊断、治疗等方面做出了巨大努力,但是,患者的5年生存率并未有显著的改善。近几年来,随着载药纳米粒子系统(DDSs)在治疗各种疾病方面有了极大的发展,特别是在肿瘤治疗领域获得了极大关注。相比普通药物,载药纳米粒子系统在提高药物稳定性、控制包载药物释放及延长药物的血液循环时间方面有极大的优势。虽然人们在纳米粒子领域取得了令人振奋的成绩,但尚未出现一种理想的载药纳米粒子,这种理想的载药纳米粒子应具有：特异性靶向作用,可控的包载药物释放及较好的生物相容性。本文介绍的纳米粒子,通过利用肿瘤高表达活性氧自由基(ROS)的特点,来实现包载药物的快速释放,通过RGD配体的修饰,来实现肿瘤特异性靶向作用,并且这种纳米粒子在生物体内的代谢物主要为PEG和PLGA,所以生物相容性较好。因此,这是一种安全、高效、靶向的、且具有ROS响应的载药纳米粒子系统,通过本文的研究,为发展载药纳米粒子治疗口腔肿瘤打下一定基础,并为口腔肿瘤的治疗提供了一种新的策略。方法：1、首先合成一种对ROS刺激发生断裂响应的酮缩硫醇(TK)链,分别连接PLGA和PEG,从而形成了一种新的同时具有亲水性和疏水性两种性质的高分子聚合物(Meo-PEG-TK-PLGA)。分别使用核磁和GPC检测这种高分子聚合物Meo-PEG-TK-PLGA的结构和成分,并使用GPC验证KO2诱导后的高分子聚合物Meo-PEG-TK-PLGA的ROS响应能力；使用纳米沉淀法制备纳米粒子,通过DLS和TEM检测Meo-PEG-TK-PLGA自组装纳米粒子的性质,通过使用含10%FBS溶液诱导,从而检测纳米粒子的稳定性；并使用含KO2的PBS溶液模拟检测纳米粒子对ROS的刺激响应能力；进行纳米粒子相关包载药物释放能力及内涵体逃逸能力的检测；通过纳米粒子的细胞毒性检测,评价高分子聚合物Meo-PEG-TK-PLGA的安全性；在评价包载阿霉素的Meo-PEG-TK-PLGA纳米粒子的抗肿瘤效果实验中,使用ROS抑制剂干扰ROS水平,从而检测ROS对载药纳米粒子Meo-PEG-TK-PLGA的药物释放能力的影响,并从另一方面验证纳米粒子具有ROS刺激响应能力；为进一步验证材料安全性,进行小鼠体内毒性实验,尾静脉注射高分子聚合物Meo-PEG-TK-PLGA后,一周后,取小鼠的心、肝、脾、肺、肾等脏器进行HE染色,检测高分子材料的安全性。2、在前一个设计合成的高分子聚合物Meo-PEG-TK-PLGA基础上,增加靶向作用,使用RGD修饰高分子材料,RGD位于纳米粒子表面,从而使此纳米粒子既具有ROS刺激响应能力,也具有肿瘤细胞的靶向作用。合成RGD-PEG和TK-PLGA,并将这两种聚合物连接起来,合成新的高分子聚合物RGD-PEG-TK-PLGA;使用核磁检测其结构,使用GPC检测其成分,并使用GPC检测其经K02诱导后产物,确定RGD-PEG-TK-PLGA合成准确性及验证聚合物的ROS刺激响应能力；使用DLS和TEM检测包载阿霉素的RGD-PEG-TK-PLGA的自组装纳米粒子在10%FBS溶液中的稳定性；检测RGD-PEG-TK-PLGA纳米粒子药物包载,释放能力；流式细胞仪检测纳米粒子的靶向作用,通过混入包载TOS的纳米粒子,提升细胞内ROS水平,提高包载阿霉素的释放量；CLSM检测RGD-PEG-TK-PLGA纳米粒子的内涵体逃逸能力及检测包载阿霉素或TOS,对细胞内ROS水平的影响,并通过荧光检测再次验；评价RGD-PEG-TK-PLGA纳米粒子的体外毒性,及包载TOS的纳米粒子的体外毒性实验,验证材料及包载TOS安全后,进行体外抗肿瘤实验,评价半致死量；体内实验使用植入Cal27肿瘤的裸鼠作为实验对象,先评价纳米粒子的药物血液代谢,评价抗肿瘤效果,检测纳米粒子通过纳米粒子的包裹,阿霉素的系统毒性及小鼠带瘤生存率的变化情况。最后再通过小鼠心、肝、脾、肺、肾的组织HE染色切片,评价纳米粒子的安全性。实验结果：1、经过核磁及GPC验证Meo-PEG-TK-PLGA结构及分子量,从而证明合成物的正确性,并通过氧化物诱导反应,验证其具有ROS刺激响应能力；通过DLS和TEM检测Meo-PEG-TK-PLGA自组装纳米粒子的粒径及其分散度,通过TEM获得纳米粒子的图像,测得纳米粒子粒径大约为90nm,并通过含10%FBS的溶液诱导实验,验证纳米粒子是稳定的；通过含有不同浓度K02的PBS溶液,检测了纳米粒子确实具有良好的ROS刺激响应能力；通过内涵体逃逸实验,证明此纳米粒子具有极强的内涵体逃逸能力；通过体外毒性实验检测,验证高分子聚合材料Meo-PEG-TK-PLGA是安全的,体外抗肿瘤实验证明包载阿霉素的Meo-PEG-TK-PLGA自组装纳米粒子具有极强的抗肿瘤疗效,并且通过ROS抑制剂干扰细胞内的ROS水平,验证了ROS刺激响应能力对抗肿瘤效果的影响；通过体内毒性实验,验证了高分子聚合物Meo-PEG-TK-PLGA是一种安全低毒的材料。2、通过核磁验证我们合成的高分子聚合物RGD-PEG-TK-PLGA结构的正确性,通过GPC检测其分子量,再次验证了合成的成功；并通过氧化物的诱导,验证了其具有的ROS刺激响应能力。TEM及DLS检测包载阿霉素的RGD-PEG-TK-PLGA自组装纳米粒子的粒径为120mm,通过含10%FBS的PBS溶液验证了此纳米粒子的稳定性。通过内涵体逃逸实验证明此纳米粒子具有较强的内涵体逃逸能力,并且通过对比发现经RGD修饰的纳米粒子组的纳米粒子逃逸明显增多,并且混有包载TOS纳米粒子组的逃逸量最多,这说明细胞内提高的ROS水平对阿霉素的逃逸有明显影响。流式细胞仪检测发现,RGD修饰对胞吞产生明显影响,但发现ROS水平改变,不会影响胞吞效果。通过体内毒性实验发现,高分子聚合材料RGD-PEG-TK-PLGA是安全的,并且包载TOS的纳米粒子的TOS剂量也是低毒性的的、安全的。通过体外抗肿瘤实验发现通过RGD-PEG-TK-PLGA纳米粒子包载阿霉素后,具有极佳的抗肿瘤效果,并且包载TOS和阿霉素纳米粒子混合后,抗肿瘤能力更强。并通过体内抗肿瘤实验再次验证了这个结果,并验证了纳米粒子包载能明显降低包载药物的毒副作用,通过带瘤生存曲线验证了包载药物进行纳米粒子治疗,可延长小鼠带瘤生存时间：最后再通过小鼠器官的组织免疫组化实验,验证了材料是安全的。结论：我们设计合成了两种高分子聚合物Meo-PEG-TK-PLGA和RGD-PEG-TK-PLGA能够通过自组装形成稳定的纳米粒子,并且这种纳米粒子是高效、安全、可具有靶向性、能够响应ROS的刺激,是一种具有极佳疗效的治疗口腔鳞癌的载药纳米粒子系统。
【关键词】：纳米粒子 ROS响应 靶向 口腔鳞癌
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.85
【目录】：

• 中文摘要8-12
• Abstract12-16
• 第一章 一种新型安全高效ROS响应的Meo-PEG-TK-PLGA纳米粒子在治疗口腔鳞癌中的研究16-36
• 1.1 研究背景16-18
• 1.2 材料与方法18-26
• 1.2.1 合成包含ROS可断裂的酮缩硫醇TK19
• 1.2.2 合成Meo-PEG-TK19
• 1.2.3 合成Meo-PEG-TK-PLGA19-20
• 1.2.4 核磁分析(NMR)20
• 1.2.5 凝胶渗透色谱(GPC)分析20
• 1.2.6 制备纳米粒子20
• 1.2.7 电镜检测(TEM)20-21
• 1.2.8 动态光散射(DLS)检测21
• 1.2.9 细胞培养21
• 1.2.10 共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)检测21
• 1.2.11 体外阿霉素释放率检测21-22
• 1.2.12 体外毒性试验22
• 1.2.14 免疫组化观察22
• 1.2.15 统计学分析22-26
• 1.3 结果及讨论26-34
• 1.3.1 ROS刺激响应的聚合物的合成26-28
• 1.3.2 纳米粒子的性质28-30
• 1.3.3 体外药物释放检测30-31
• 1.3.4 激光共聚焦层扫显微镜检测(CLSM)31-34
• 1.3.5 体外毒性实验34
• 1.4 结论34-36
• 第二章 新型安全高效靶向ROS响应的RGD-PEG-TK-PLGA纳米粒子用于治疗口腔鳞癌的研究36-67
• 2.1 背景介绍36-38
• 2.2 材料与方法38-44
• 2.2.1 合成包含ROS可断裂键的酮缩硫醇TK39
• 2.2.2 合成RGD-PEG-NH239
• 2.2.3 合成HOOC-TK-PLGA39-40
• 2.2.4 合成RGD-PEG-TK-PLGA40
• 2.2.5 核磁分析(NMR)40
• 2.2.6 凝胶渗透色谱(GPC)分析40
• 2.2.7 制备纳米粒子40-41
• 2.2.8 电镜检测(TEM)41
• 2.2.9 动态光散射(DLS)检测41
• 2.2.10 细胞和动物培养41
• 2.2.11 共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)检测41-42
• 2.2.12 体外药物素释放率检测42
• 2.2.13 流式细胞仪分析42-43
• 2.2.14 体外毒性实验43
• 2.2.15 体内代谢检测43
• 2.2.16 体内毒性、抗肿瘤及带瘤生存实验43-44
• 2.2.17 免疫组化观察44
• 2.2.18 统计学分析44
• 2.3 结果及讨论44-66
• 2.3.1 RGD修饰的ROS刺激响应的聚合物的合成44-47
• 2.3.2 纳米粒子的鉴定47-49
• 2.3.3 体外药物释放检测49-51
• 2.3.4 激光共聚焦层扫显微镜检测(CLSM)51-54
• 2.3.5 流式细胞仪检测实验54-55
• 2.3.6 体外毒性实验55-57
• 2.3.7 体外抗肿瘤实验57-60
• 2.3.8 体内循环实验60-62
• 2.3.9 体内抗肿瘤实验62-63
• 2.3.10 体内毒性实验63-66
• 2.4 结论66-67
• 第三章 纳米医学的发展及临床转化研究67-76
• 3.1 高分子聚合物类的纳米粒子的包载药物的可控释放70
• 3.2 纳米粒子靶向性,主动靶向和被动靶向70-73
• 3.2.1 纳米粒子被动靶向作用70-71
• 3.2.2 纳米粒子的血液循环71-72
• 3.2.3 主动靶向72-73
• 3.3 制备高分子纳米粒子73-75
• 3.3.1 制备高分子纳米粒子的方法73-74
• 3.3.2 药物包载方式74-75
• 3.4 结论75-76
• 参考文献76-89
• 致谢89-90
• 学位论文评阅及答辩情况表90

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