氯通道ClC-7对牙囊细胞生物学特性影响的体外研究

发布时间：2017-08-16 05:19

  本文关键词：氯通道ClC-7对牙囊细胞生物学特性影响的体外研究

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【摘要】：电压门控氯离子C1C家族成员在不同的生物类群中均有分布,并具有不同的生物学作用,如稳定膜电压、离子转运和细胞器酸化等。C1C家族成员的重要性表现在某些氯离子通道基因的缺陷能导致遗传性疾病的发生,如：先天性肌强直、Dent's病、骨硬化症、原发性癫痫等。ClC家族包括三个亚类,共有9个家族成员,它们分别是ClC-1～7,ClC-Ka, CIC-Kb。ClC家族的第三支包括C1C-6和C1C-7,它们在许多不同类型的组织上都有表达,发挥着调节胞内细胞器囊泡pH值的作用。C1C-7是这个离子通道家族中表达最广泛的成员之一,存在于晚期胞内体、溶酶体和破骨细胞的皱褶缘膜中。人类C1C-7是由CLCN7基因编码的,其功能异常影响破骨细胞介导的细胞外酸化作用,导致骨无机物的溶解障碍和一系列的临床症状。在本课题组前期的临床和基础研究中,发现牙的发育和ClC-7分子密切相关。一方面,CLCN7基因突变所引起的骨硬化症患者可出现牙根发育不全及牙萌出受阻,部分牙有釉质发育不全等异常表现；另一方面,CLC-7蛋白在小鼠牙胚发育的各个阶段均有表达。据此推测C1C-7在牙发育和萌出中可能起着重要的作用。牙囊起源于外胚间充质,是包绕在成釉器周围和牙乳头底部的呈囊状排列的结缔组织,其在牙齿萌出后期形成牙骨质、牙周膜和固有牙槽骨。牙囊是牙萌出的必需条件之一,其在组织、细胞和分子多个水平上调控牙齿的萌出。基于牙囊细胞在牙发育和萌出中的重要地位,为了验证C1C-7在牙萌出中发挥重要功能的假说,本实验采用小鼠牙囊细胞(Dental Follicle Cells,DFCs)为体外实验模型；首先探索小鼠牙囊细胞体外分离培养的合适方法,其次检测C1C-7在DFCs的表达情况,并通过构建慢病毒shRNA载体干扰DFCs中C1C-7的表达,建立C1C-7缺陷的小鼠牙囊细胞模型,观察ClC-7表达降低后相关基因的变化；在体外模拟成骨细胞和破骨前体细胞的相互作用,建立DFCs/MNCs(骨髓单核细胞)直接共培养体系,检测DFCs中C1C-7表达降低后对形成破骨细胞分化和功能的影响：通过采用人工成熟配方的矿化诱导液和模拟天然环境的牙本质浸提液,分别对DFCs进行诱导,检测两种诱导液对DFCs成骨/成牙本质／成牙骨质分化中相关基因表达的影响,检测DFCs中C1C-7表达降低后对成骨／成牙本质／成牙骨质分化中相关基因表达和对矿化结节形成能力的影响。方法：实验一：采用出生后3-5天的仔鼠,二次酶消化法分离牙囊细胞进行原代培养,观察各代牙囊细胞生长状态和特点,通过免疫细胞化学染色法检测波形蛋白和角蛋白在所分离细胞的表达情况,鉴定细胞来源。实验二：构建慢病毒Clcn7-shRNA载体并体外转染DFCs, qRT-PCR检测其对C1C-7表达水平的干扰效果,并且检测C1C-7沉默后对DFCs破骨和成骨等相关功能分子表达水平变化的影响,免疫细胞化学染色法检测CLC-7在DFCs的表达情况。实验三：建立DFCs/MNCs共培养体系,通过TRAP染色和牙片吸收实验,即分别计数形成多核破骨样细胞的数目、牙片上形成吸收陷窝的数目和面积,检测降低DFCs的C1C-7表达水平后对共培养体系中破骨细胞分化和功能的影响。实验四：采用矿化诱导液和牙本质浸提液对DFCs进行诱导,qRT-PCR检测两种诱导液对DFCs成骨／成牙本质／成牙骨质分化相关基因表达的影响,检测降低DFCs C1C-7表达水平后对以上基因表达水平的影响,茜素红染色检测矿化诱导液在降低DFCs的C1C-7表达水平后对其矿化结节形成能力的影响。结果：1.采用二次酶消化法分离培养小鼠牙囊细胞,24小时后见散在细胞集落生成。细胞呈放射状或漩涡状生长,为典型成纤维细胞表现。3-5天细胞集落融合,铺满板底。细胞呈现为多突起的梭形细胞和多角形细胞两种细胞形态混杂生长,两种细胞群体之间界限不清。体外培养3-5天细胞生长接近融合,传代12h后细胞恢复形态贴壁生长,大部分呈梭形,多角形细胞比例减少。第三代细胞生长速度最快,2～3天细胞数量倍增,细胞大小较为一致,胞体较丰满,立体感强,细胞呈多形型,部分细胞呈树突型或水滴型,多角形细胞基本消失。第四代细胞生长速度明显下降,细胞表面积变大,形态异型性明显,胞体趋于扁平,含2个胞核的细胞增多。第五代细胞生长接近停滞,表面积和形态变化、细胞间差异更为明显。免疫细胞化学染色显示分离培养细胞为波形蛋白VIM呈阳性表达,角蛋白CK呈阴性表达。2.慢病毒转染DFCs 72h后,荧光显微镜下大部分的细胞可见绿色GFP荧光,qRT-PCR结果显示转染Clcn7-shRNA慢病毒载体能显著下调ClC-7在DFC中的表达水平。进一步通过qRT-PCR检测成骨相关功能分子Opg、Bsp、Opn、 Oc、Alp、Bmp2、Col1、釉质和牙本质的基质蛋白分子Dspp、Dmp1、Amelogenin、 Enamelin和成牙骨质细胞标志分子Cap在DFCs中mRNA表达水平,结果显示Opg、Opn、Alp、Cap、Rank、Ctsk、M-csf、Rankl、Runx2和Tfgb1在DFCs中的表达较高,其它分子Dspp、Dmp1、Amelogenin、Enamelin、Oc、Bsp、Bmp2、Trap在DFCs中几乎不表达或痕量表达。和negative-shRNA转染组相比,Clcn7-shRNA转染组Opg发生上调,Opn、Alp、Cap、Rank1发生下调并具有统计学意义,而Rank、Ctsk、M-csf和Tfgb1有上调趋势但无统计学差异。在蛋白表达水平方面,免疫细胞化学染色法结果表明CLC-7在DFCs中呈阳性表达。3. DFCs/MNCs共培养期间可见到MNCs贴壁聚集成结节样结构,DFCs在镜下呈类圆形且较为通透多突触的神经元样细胞,MNCs围绕DFC并聚集在其周围。DFCs/MNCs共培养7天后能看到众多TRAP阳性细胞,其中有一部分为多核细胞。共培养14天后扫描电镜下能看到牙片上有散在的吸收陷窝。TRAP染色计数Clcn7-sh RNA组的多核TRAP阳性细胞数目少于negative-shRNA组和空白对照组,negative-shRNA组和空白对照组之间无统计学差异。牙片吸收实验Clcn7-shRNA组的每视野牙片吸收陷窝数目少于negative-shRNA组空白对照组,Clcn7-shRNA组的平均吸收陷窝面积小于negative-shRNA组和空白对照组,negative-shRNA组和空白对照组之间无统计学差异。4.采用矿化诱导液对DFCs进行诱导3天,qRT-PCR检测结果显示成骨分化相关基因Bsp、Opn、Alp、Col1,成牙骨质分化相关基因Cap和重要信号通路分子Tgfb1的mRNA水平均发生了明显的上调,其中Bsp、Opn和Cap的上调幅度达数十倍甚至数百倍；采用Clcn 7-shRNA慢病毒载体降低DFCs中Clcn7的表达水平,矿化诱导液诱导3天,1Bsp、Alp、Col1和Tgfb1的mRNA水平均发生了明显的上调。采用慢病毒载体降低DFCs中Clcn7的表达水平,矿化诱导液诱导7、14、21天,茜素红染色和茜素红溶解定量实验显示Clcn7抑制组和对照组形成矿化结节的能力无差异。采用牙本质浸提液对DFCs进行诱导3天,qRT-PCR检测结果显示成骨分化相关基因Bsp、Opn、Alp、Col1和重要信号通路分子Tgfb1的mRNA水平均发生了明显的上调,其中Opn的上调幅度达百倍以上；采用Clcn7-shRNA慢病毒载体降低DFCs中Clcn7的表达水平后进行牙本质浸提液诱导3天,所检测基因分子的mRNA表达水平均发生不同程度的降低,其中成骨分化相关基因Bsp、Alp、Opn和重要信号通路分子Tgfb1的改变较显著。结论：1.采用二次酶消化法进行小鼠牙囊细胞原代培养可在短时间内获得较多的细胞,操作简便且成功率高,是一种较理想的小鼠牙囊细胞培养方法。免疫细胞化学染色结果证明分离的细胞为间充质来源,结合取材部位,说明分离所得细胞为DFCs。应选用状态最佳的第三代小鼠牙囊细胞进行各类实验。2.C1C-7在DFCs中有丰富的表达。DFCs中C1C-7表达水平的降低导致成骨相关功能分子和RANK-RANKL-OPG信号轴表达水平的改变,提示DFCs的功能可能与成骨细胞相似,C1C-7在DFCs中可能通过成骨途径及RANK-RANKL-OPG信号轴发挥作用。3.DFCs/MNCs共培养体系能模拟DFCs在牙萌出过程的募集和诱导作用,促进MNCs分化为OCLs,降低DFCs的C1C-7表达水平导致OCLs数目减少及其骨质吸收功能降低。4.矿化诱导液能诱导DFCs向成骨/成牙骨质向分化,而牙本质浸提液仅能诱导DFCs向成骨方向分化,无成牙骨质向分化的诱导作用。TGF-β1可能参与了C1C-7对DFCs多向分化的调控。
【关键词】：小鼠牙囊细胞 ClC-7 破骨细胞 牙本质浸提液 成骨/成牙骨质细胞向分化
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R78
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-14
• 前言14-16
• 第一章 小鼠牙囊细胞的体外分离培养和鉴定16-23
• 1 材料与方法16-19
• 2 结果19-21
• 3 讨论21-23
• 第二章 ClC-7对牙囊细胞一般生物学性状及功能分子表达的影响23-35
• 1 材料与方法23-29
• 2 结果29-32
• 3 讨论32-35
• 第三章 ClC-7对牙囊细胞介导的破骨细胞分化功能的调控35-45
• 1 材料与方法35-39
• 2 结果39-41
• 3 讨论41-45
• 第四章 ClC-7对牙囊细胞多向分化功能的调控45-55
• 1 材料与方法45-48
• 2 结果48-53
• 3 讨论53-55
• 全文总结55-57
• 综述一 牙囊细胞研究进展57-72
• 综述二 氯通道ClC-7研究进展72-76
• 参考文献76-98
• 缩略词表98-100
• 致谢100-102

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 孙海燕;金作霖;张永宽;林珠;;体外培养人牙囊细胞表达的OPG和RANKL对破骨细胞表型分化的影响[J];中国美容医学;2009年08期

2 葛少华,李德懿,杨丕山;小鼠牙囊细胞的体外分离培养鉴定及异质性研究[J];上海口腔医学;2004年06期

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本文编号：681630