CD63对TCA8113细胞侵袭转移影响的初步研究

发布时间：2017-08-18 21:19

  本文关键词：CD63对TCA8113细胞侵袭转移影响的初步研究

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【摘要】：目的通过免疫组化技术,探寻CD63表达量与舌鳞状细胞癌病理分化程度之间的关系,通过RNA干扰技术和体外转染技术改变舌鳞癌细胞TCA8113细胞CD63的表达量,筛选低表达和过表达CD63蛋白的TCA8113细胞株,初步探索CD63表达量的改变对舌鳞癌细胞侵袭转移的影响。方法1、选取32例不同病理分化程度的舌癌组织样本,应用免疫组织化学技术分析舌癌组织分化程度和CD63表达量之间的关系。2、根据人CD63的m RNA序列(NM_001780.5),设计3个针对该序列的sh RNA编码克隆,插入含有h U6-MCS-CMV-GFP-SV40-Neomycin元件的基因沉默表达质粒GV102中,转染293T细胞,48h后采用Real-Time PCR及Western Blot检测干扰效率并筛选最有效的干扰片段,将有效sh RNA质粒瞬时转染TCA8113细胞,G418筛选得到CD63消减沉默的稳定细胞株,命名为CD63-L。3、设计CD63特异性引物,提取TCA8113细胞总RNA,RT-PCR方法构建PEGFP-N3-CD63真核表达质粒,经酶切和测序正确后瞬时转染TCA8113细胞,G418筛选得到过表达CD63的稳定细胞株,命名为CD63-H,采用Western Blot方法检测CD63表达,共聚焦显微镜观察蛋白表达和定位。4、Western Blot检测正常TCA8113细胞(CON)、CD63消减沉默细胞(CD63-L)、CD63过表达细胞(CD63-H)基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达量的差异,划痕实验检测三种细胞系划痕愈合速度的差异,transwell实验检测CON、CD63-L、CD63-H三株细胞特定时间点穿过基质膜的细胞数量,分析不同CD63表达量对TCA8113细胞侵袭转移能力的影响。结果1、正常舌组织内CD63呈棕黄色颗粒状着色,着色程度较深,主要表达于细胞膜和细胞质。随着舌鳞癌组织分化程度降低,着色程度逐渐变弱,且均弱于正常舌组织,方差分析各组间CD63表达量的差异,P0.05,说明CD63表达量与舌癌组织分化程度之间成正相关关系。经t检验得知,随着舌癌分化程度降低,CD63表达量降低,而舌癌发生淋巴结转移的可能性增加,P0.05,即CD63表达量和舌癌淋巴结转移间成负相关关系。2、sh RNA质粒能够高效转染293T细胞,Real-Time PCR及Western Blot结果显示,CD63-RNAi-4041干扰效果最好,在m RNA水平和蛋白水平干扰效率分别为88%和74%,经方差分析,P0.05。采用600ug/ml G418筛选,成功获得CD63消减沉默的TCA8113细胞株,命名为CD63-L。3、经酶切鉴定和测序,成功构建PEGFP-N3-CD63真核表达质粒。经600ug/ml G418筛选,得到稳定高表达CD63的TCA8113细胞株,与正常未转染细胞相比,CD63表达增加32%,命名为CD63-H,共聚焦显微镜观察CD63蛋白主要表达于细胞膜。4、Western Blot结果示,与CON相比,CD63-L细胞内MMP-2、MMP-9表达量分别升高60%、61%,而CD63-H细胞内MMP-2、MMP-9表达量分别减低29%、41%,经方差分析,均有P0.05。细胞划痕实验结果示,与CON组相比,CD63-L细胞愈合速度增快73%,而CD63-H相比愈合速度减慢约59%。Transwell实验表明,CD63-L穿膜细胞数量较CON增多约70%,而CD63-H穿膜细胞数量较CON减少约68%,经方差分析,P0.05,差异具有统计学意义。结论1、舌鳞癌组织样本中CD63表达量与肿瘤分化程度成正相关,与舌癌是否发生淋巴结转移成负相关。2、成功筛选得到CD63消减沉默的TCA8113细胞株CD63-L。3、成功筛选得到CD63过表达的TCA8113细胞株CD63-H。4、MMP-2、MMP-9表达量、细胞划痕愈合速度、穿膜细胞的数量均与CD63表达量成反比,初步探明CD63表达量与舌癌细胞侵袭转移能力成负相关。
【关键词】：舌癌 CD63 RNA干扰 侵袭 转移
【学位授予单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.86
【目录】：

• 中文论著摘要5-8
• 英文论著摘要8-12
• 英文缩略语表12-13
• 前言13-15
• 材料与方法15-28
• 结果28-44
• 讨论44-49
• 结论49-50
• 本研究创新性的自我评价50-51
• 参考文献51-54
• 综述54-62
• 参考文献58-62
• 在学期间科研成绩62-64
• 致谢64-66
• 个人简介66-67

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本文编号：696832