肾上腺髓质素对人牙髓干细胞的调控作用及机制研究

发布时间：2017-08-18 21:25

  本文关键词：肾上腺髓质素对人牙髓干细胞的调控作用及机制研究

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【摘要】：目的当龋病进展侵犯到牙髓时,牙髓可以通过形成修复性牙本质来保护牙髓的健康。DPSCs现在被认为是修复性牙本质形成的一个重要来源,DPSCs具有多向分化的潜能,目前的研究认为成牙本质分化对于牙髓损伤后修复性牙本质的形成起到关键作用。然而目前DPSCs的增殖及分化机制尚未完全确定。研究显示,ADM在牙齿的发育过程中,在关键的发育时间点呈现高表达,并且ADM对成骨现象存在明显的调控作用,而成骨和成牙本质具有很多的相似性。本课题组通过前期检测离体牙牙髓组织的实验发现,相比于正常牙髓,牙髓损伤组织ADM明显呈高表达,并且表达部位集中于损伤牙髓部位和修复性牙本质周围。因此本课题组推测ADM可能对DPSCs的增殖分化具有一定的调节作用。本研究旨在:(一)检测ADM在龋病牙髓组织内的表达情况以及ADM和龋坏程度的相关性。(二)体外分离、培养、鉴定原代DPSCs。(三)通过在DPSCs培养基内加入ADM刺激,研究ADM对DPSCs增殖、凋亡的调控作用以及其作用机制。(四)研究ADM对DPSCs的成牙本质分化的调控作用及其作用机制。方法1.龋坏程度和ADM表达水平的相关性研究收集我院临床拔除的智齿195例,包括龋病95例(根据龋病分类分为浅龋44例、中龋32例、深龋19例)和健康离体牙100例,拔除后立即取出牙髓组织,ELISA检测ADM在牙髓液中的表达水平,免疫组织化学检测ADM在牙髓组织中的表达及细胞定位,利用t检验进行统计学分析。2.DPSCs的培养和鉴定利用临床拔除的健康离体牙的牙髓组织剪碎进行培养,采用酶消化及过滤的方法得到单细胞悬液,有限稀释法原代培养。扩大培养细胞至第3代,细胞免疫荧光检测STRO-1/CD146等DPSCs标志物的表达。体外诱导分化后检测ALP活性,矿化结节形成情况,以及DSP表达,明确DPSCs是否具有成牙本质分化的潜能。3.adm对dpscs增殖、凋亡的调控作用及机制研究原代dpscs培养至第3代,加入不同浓度adm干预后,通过流式细胞检测细胞周期及细胞凋亡情况,通过westernblot检测凋亡蛋白的表达,观察adm对于dpscs增殖能力的影响。通过westernblot检测调控细胞增殖关键信号通路蛋白jnk/c-jun的表达和磷酸化水平,以及调控细胞凋亡关键信号通路蛋白src/gsk-3β的表达和磷酸化水平。此外通过adm及jnk/c-jun通路抑制剂sp600125共处理,以及adm与src/gsk-3β通路抑制剂pp2共处理,探讨adm是否通过激活src/gsk-3β通路及src/gsk-3β通路分别调控dpscs增殖及凋亡的。4.adm对dpscs成牙本质分化的作用及机制研究原代dpscs培养至第3代,加入adm(10-8mol/l)处理24小时,通过westernblot检测成牙本质分化相关标志蛋白的表达,同时检测creb及磷酸化creb、bmp2表达水平。通过荧光素酶活性报告实验以及chip检测creb对于bmp2的转录结合位点。此外,在adm处理细胞同时加入h89抑制creb磷酸化,或在adm处理细胞同时加入noggin抑制bmp通路,观察adm是否通过激活creb/bmp通路进而促进dpscs成牙本质分化。结果1.龋病和adm表达水平的相关性研究elisa检测结果显示:龋坏组的牙髓组织液中adm水平显著高于健康组,此外发现,在深龋组、中龋组、浅龋组的牙髓组织液中深龋组adm水平显著高于中龋组和浅龋组,中龋病人adm水平显著高于浅龋组。通过免疫组织化学检测发现adm在龋坏相邻的牙髓范围内染色显示高表达,并且在修复性牙本质周围更为显著。2.dpscs的培养和鉴定7天后少数细胞增殖能力旺盛形成克隆,细胞呈stro-1及cd146阳性。矿化诱导培养后,细胞可形成矿化结节,alp活性显著升高,westernblot检测显示细胞表达dsp蛋白。3.adm对dpscs增殖、凋亡的调控作用及机制研究10~(-7)m-10-10madm处理细胞后24hr,adm处理组g2/s/m期细胞比例显著上升而细胞倍增时间显著低于空白对照组,其中10~(-7)m及10-8madm处理组无显著差异,但促进dpscs增殖的作用显著高于其他2组。10-8madm处理后,dpscs中jnk/c-jun蛋白磷酸化水平明显增加,10-8madm联合10μmsp600125处理后,jnk/c-jun磷酸化水平降低,细胞增殖能力显著下降。10~(-7)m-10-10madm处理细胞后24hr,adm处理组细胞凋亡率及caspase3表达水平显著下降,其中10~(-7)M及10-8M ADM处理组之间无显著差异,但抑制DPSCs凋亡的作用显著高于其他2组。10-8M ADM处理后,DPSCs中Src/GSK-3β蛋白磷酸化水平显著增加,10-8M ADM联合20μM PP2处理DPSCs,Src/GSK-3β磷酸化水平降低,细胞凋亡率显著上升。4.ADM对DPSCs成牙本质分化的作用及机制研究10~(-7) M ADM处理DPSCs后,Alizarin red S染色水平显著高于对照组。Western blot检测结果显示,ADM处理组RUNX2/ALP/OCN蛋白表达水平均显著高于对照组。此外,ADM处理组p CREB表达水平较对照组显著上升,但细胞总CREB水平未见显著变化。定量PCR和Western blot结果显示ADM处理组BMP2 mRNA和蛋白表达水平均较对照组显著上升。荧光素酶活性报告及ChIP结果显示CREB可通过结合BMP2启动子-1094至-669区域促进BMP2的转录。10~(-7) M ADM/5μM H89共处理后p CREB/BMP2/RUNX2/ALP/OCN表达水平均显著低于单独ADM处理,而10~(-7) M ADM/100ng mL Noggin共处理后RUNX2/ALP/OCN表达水平均显著低于单独ADM处理。结论1.ADM在龋病牙髓组织高表达,并且与龋病的进展呈现正相关。2.从成体人牙髓组织中可分离培养出DPSCs,具有成牙本质分化能力。3.ADM通过激活JNK/c-Jun信号通路促进DPSCs的增殖,通过激活Src/GSK-3β信号通路抑制DPSCs凋亡。4.ADM通过促CREB磷酸化进而上调BMP转录表达的途径促进DPSCs成牙本质分化。
【关键词】：肾上腺髓质素 人牙髓干细胞 增殖 凋亡 成牙本质分化 JNK/c-Jun信号通路 Src/GSK-3β信号通路 CREB BMP
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R781.1
【目录】：

• 缩略语表5-6
• 英文摘要6-11
• 中文摘要11-14
• 第一章 前言14-19
• 1.1 研究背景14-15
• 1.2 课题设计15-17
• 参考文献17-19
• 第二章 龋病和ADM的相关性研究19-31
• 2.1 前言19
• 2.2 材料与方法19-24
• 2.3 结果24-27
• 2.4 讨论27-28
• 2.5 结论28-29
• 参考文献29-31
• 第三章 人DPSCs的体外培养和鉴定31-42
• 3.1 前言31
• 3.2 材料与方法31-34
• 3.3 结果34-38
• 3.4 讨论38-39
• 3.5 结论39-40
• 参考文献40-42
• 第四章 ADM对DPSCs增殖和凋亡的作用及机制研究42-61
• 4.1 前言42
• 4.2 材料与方法42-49
• 4.3 结果49-55
• 4.4 讨论55-57
• 4.5 结论57-58
• 参考文献58-61
• 第五章 ADM对DPSCs成牙本质分化的作用及机制研究61-86
• 5.1 前言61-62
• 5.2 材料与方法62-73
• 5.3 结果73-79
• 5.4 讨论79-80
• 5.5 结论80-81
• 参考文献81-86
• 全文总结86-88
• 文献综述一 ADM在牙体组织中的作用88-97
• 参考文献92-97
• 文献综述二 DPSCs以及iPS的应用及未来97-109
• 参考文献103-109
• 攻读学位期间的研究成果109-110
• 致谢110

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