bmper、microRNA-23a对斑马鱼颅面软骨发育的影响及nkx2.3转基因鱼的构建

发布时间：2017-08-20 03:09

  本文关键词：bmper、microRNA-23a对斑马鱼颅面软骨发育的影响及nkx2.3转基因鱼的构建

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【摘要】：颅面畸形是一种常见的胎儿出生缺陷,是由于颅面骨发育异常造成的结构紊乱。研究表明,BMP信号通路和nicroRNAs在斑马鱼的胚胎发育中具有重要功能,尽管一些BMP信号的调控分子和：nicroRNAs已经被证明与胚胎的软骨发育有关,但是它们在软骨发育过程中的功能还所知甚少。Bmper是BMP信号通路中位于细胞外的调控分子。bmper基因的突变,在人类中导致一种称为DSD(Diaphonospondylodysostosis)的罕见隐性遗传的骨骼发育不良疾病,患病婴儿具有脊柱严重骨化、体节缺陷、肾脏结构异常等特征。在本研究中,通过对bmper时空表达谱的研究,我们发现bmper在斑马鱼的头部咽区部位有显著表达。通过反义寡核背酸morpholino敲低bmper的表达,结果导致斑马鱼的颅面骨大部分缺失。然后,我们利用Cas9/gRNA技术构建bmper突变体,希望在突变体中观察到与注射norpholino类似的表型。miR-23a属于miR-27a、miR-23a、miR-24-2家族的一员。通过反义寡核苷酸morpholino敲低miR-23a的表达,发现斑马鱼咽部软骨大部分缺失。进一步,我们利用Tg(sox10:EGFP)转基因鱼研究miR-23a对咽软骨发育影响,发现其影响神经嵴细胞的迁移和软骨前体细胞的分化。另外,咽囊的发育对斑马鱼的颅面骨形成具有重要影响,为了深入研究斑马鱼的咽囊发育,我们利用To12转座子和Cre-loxP技术构建Tg(nkx2.3:CreERT2)和Tg(nkx2.3:EGFP-CAAX)转基因鱼品系。综上所述,本研究表明,敲低bmper、miR-23a的表达严重影响斑马鱼的颅面骨发育,我们期望通过进一步的深入研究,揭示这两个基因影响颅面骨发育的具体机制,为与颅面骨畸形相关疾病的诊断和分析提供科学依据。我们成功构建了Tg(nkx2.3:CreERT2)和Tg(nkx2.3:EGFP-CAAX)转基因鱼,为与咽囊相关的研究工作提供了重要的工具。
【关键词】：bmper miR-23a 颅面软骨 nkx2.3转基因鱼 CreERT2 绿色荧光蛋白
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R782;Q78
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-9
• 第一章 绪论9-32
• 1.1 斑马鱼颅面骨的发育过程9-15
• 1.1.1 斑马鱼的颅面骨结构9-11
• 1.1.2 神经嵴细胞11-14
• 1.1.3 颅面骨形成过程中的细胞聚集和分化14-15
• 1.2 咽弓的形成15-16
• 1.3 斑马鱼的咽囊发育16-17
• 1.4 TGF-β超家族和BMP信号通路17-21
• 1.4.1 TGF-β超家族18-19
• 1.4.2 BMP信号通路19-21
• 1.5 bmper的研究进展21-23
• 1.6 MicroRNAs在颅面骨发育过程中的作用23-25
• 1.6.1 MicroRNAs的形成及作用机制23-25
• 1.6.2 MicroRNAs在骨发育过程中的功能研究进展25
• 1.6.3 microRNA-23a的研究进展25
• 1.7 Tol2转座子及其在斑马鱼中的应用25-27
• 1.8 Cre重组酶介导的种系追踪27-30
• 1.9 本课题研究的内容和意义30-32
• 第二章 材料与方法32-40
• 2.1 斑鱼胚胎的培养32
• 2.2 质粒构建与转座酶mRNA体外合成32-33
• 2.3 Morpholino33-34
• 2.4 显微注射与转基因鱼构建34-35
• 2.5 原位杂交35-39
• 2.5.1 RNA探针制备35-36
• 2.5.2 胚胎的准备36
• 2.5.3 整胚原位杂交36-38
• 2.5.4 原位杂交溶液配制38-39
• 2.6 阿尔新蓝染色39-40
• 第三章 bmper对斑马鱼颅面软骨形成的影响40-45
• 3.1 bmper的保守性分析和时空表达谱的鉴定40-41
• 3.2 敲低bmper影响斑马鱼胚胎颅面软骨的发育41-42
• 3.3 斑马鱼bmper突变体的构建42-45
• 第四章 miR-23a对斑马鱼咽软骨形成的影响45-49
• 4.1 敲低miR-23a引起斑马鱼胚胎发育缺陷45-46
• 4.2 敲低miR-23a影响斑马鱼颅面骨的发育46
• 4.3 敲低miR-23a影响神经嵴细胞的迁移46-47
• 4.4 Tg(sox10：EGFP)转基因鱼咽软骨发育过程的观察47-48
• 4.5 本章小结48-49
• 第五章 咽囊细胞追踪系统的构建49-52
• 5.1 斑马鱼胚胎的注射及筛选49-50
• 5.2 F_0代斑马鱼的筛选及荧光表达分析50-52
• 第六章 Tg(nkx2.3：EGFP-CAAX)转基因斑马鱼的构建52-54
• 6.1 斑马鱼胚胎的注射及筛选52
• 6.2 F_0代斑马鱼的筛选及荧光表达分析52-54
• 第七章 结论54-55
• 7.1 bmper对斑马鱼颅面骨发育的影响54
• 7.2 microRNA-23a影响斑马鱼的咽弓发育54
• 7.3 nkx2.3转基因鱼的构建54-55
• 参考文献55-64
• 致谢64

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本文编号：704305