纳米结构脂质载体载辛伐他汀体内外成骨性能及成骨机制的研究

发布时间：2017-08-26 11:37

  本文关键词：纳米结构脂质载体载辛伐他汀体内外成骨性能及成骨机制的研究

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【摘要】：近年来,口腔种植修复技术已成为治疗牙列缺损及无牙合患者的主要修复方式。然而,多种因素导致的牙槽骨吸收大大限制了口腔种植修复技术的应用,如：龋病、牙周炎等长期缺牙后造成的牙槽嵴较严重的垂直向或水平向骨吸收,丧失量可达到原有骨宽度的50%;外伤或颅颌面部肿瘤导致牙齿缺失的同时伴有牙槽嵴部分或大范围的缺损；患有先天性畸形或先天性基因缺陷的患者与生俱来伴有牙齿和牙槽骨的发育不全；以及近年来因人口老龄化现象而日益增多的骨质疏松症导致骨密度下降和骨吸收加快。而种植区牙槽骨的体积和骨的质量又是影响种植修复成功的关键因素。因此,如何解决种植术区骨量不足或大范围骨缺损,促进骨组织再生,恢复患者颌骨形态及功能,是近年来研究的一大热点。全球每年与骨组织再生相关的手术多达130余万,治疗方案从自体骨移植、同种异体骨移植、异种骨组织移植、新型骨替代材料移植、引导骨再生到骨组织工程技术等都有大量的研究和报道。尽管这些方法已经取得了巨大的进展,但仍存在各种各样的问题,如：技术复杂、费用高、周期长、生物安全性不足等,骨组织工程技术还存在支架材料强度差、种子细胞来源受限、外源性生长因子价格昂贵等。因此,寻找一种简单、廉价、安全且能诱导内源性骨组织生长因子的方法来促进骨组织再生是目前口腔种植领域关注的一个热点。有学者发现辛伐他汀小分子药物可以诱导自身骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞并促进内源性BMP-2成骨因子表达的作用,因此,把辛伐他汀应用于骨组织再生领域引起新的关注。辛伐他汀(simvastatin, SV)是一种无活性的小分子内酯类药物,它是羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-COA)还原酶抑制剂,临床上常用的一类降高血脂、降胆固醇类药物,进入人体后经由肝脏细胞内活性酶转化成可抑制甲羟戊酸合成功能的活性体。自1999年Mundy等首次从3000多种临床药物中筛选出他汀类药物(SV和洛伐他汀)可促进体内外成骨细胞中BMP-2基因的表达,越来越多的焦点集中在SV成骨性能的研究,并证明SV有较好的促成骨作用,包括可以促使BMSCs向骨缺损部位的迁移,促进成骨细胞的分化以及促进血管生成,同时还可以抑制破骨细胞的作用。但口服SV后,只有小于5%的药物进入体循环,大部分被肝脏代谢,到达骨组织部位且可被利用的药物浓度更低,远远达不到促进新骨形成所需的剂量,而大剂量应用时可能会引起横纹肌溶解等并发症。因此,如何优化SV的可利用度,提高其局部的药物浓度,是目前亟待解决的问题之一。药物缓释系统是将纳米新型技术与临床药物优化结合的一种体现形式。良好的药物缓释系统可以在起到治疗作用的同时降低药物可能的毒副作用,实现药物缓释和靶向性,并避免药物的过早扩散和清除。纳米技术已被广泛应用于提高难溶性药物(如紫杉醇等抗肿瘤性药物)生物利用度领域中,采用的制剂形式多样并取得了显著成果,如聚合物纳米粒、纳米混悬剂、脂质体、微乳、脂质纳米粒、胶束等。其中以天然或合成的类脂为原料的脂质类纳米载体可以有效增加难溶性药物的溶解度,尤其适用于生物药剂学分类系统(BCS)中Ⅱ类(低溶解度,高渗透性)和Ⅳ类药物(低溶解度,低渗透性)的递送；可以有效增加药物的跨膜转运能力；进入体内可被巨噬细胞作为外界异物吞噬,具有较强的被动靶向性并选择性的集中于网状内皮系统,特异性地靶向肝脾组织；同时纳米载体可以延长药物在血液中滞留时间,起到一定的缓释药物储库作用;且类脂材料无毒、无免疫原性、易被机体吸收,同时避免使用毒性较大的表面活性剂和有机溶剂；给药途径多样化,易于多功能表面修饰,且有良好的市场前景等。第二代脂质纳米粒-纳米结构脂质载体(nanostructured liquid carriers, NLC)是采用液态脂质(如油酸、蓖麻油、中链脂肪酸甘油酯等)和固体脂质混合作为脂质材料而制成的纳米粒,由于液体脂质的参与,可以显著提高药物的载药量,并打乱了固体脂质原本的有序结构,使脂质结构更加稳定,不易发生晶型转变而结晶,从而提高了药物的载药率和稳定性。有学者研究发现纳米结构脂质载体载辛伐他汀(nanostructured lipid carriers containing simvastatins, SNs)相比单纯的SV混悬液有延迟药物缓慢释放的作用。也有研究表明SNs较单纯的SV生物利用度提高了2.55倍,在大鼠肠道的吸收明显高于游离SV。但前研究者所采用的制备纳米脂质体的溶剂注射法和超声乳化法均会引入部分有机溶剂,并残留于最终产品中,且目前尚未见纳米结构脂质载体载SV用于骨再生方面的报道。因此,我们假设采用微射流法可以很好的实现NLC对SV的包裹,且相比同等含量的单纯SV药物有较好的体外释放能力,同时,纳米结构脂质载体载SV较单纯SV药物有更好的促成骨作用。本实验拟采用较新的微射流技术(Microfluidization)制备SNs,避免有机溶剂的使用且操作简单；拟用MG-63成骨细胞为模型,来验证SNs的促成骨性能,并探讨相关促成骨机制；并拟通过建立兔颅骨标准骨缺损,来进一步验证SNs的促成骨性能和相关成骨机制。以期寻找更好的药物缓释系统,提高SV的生物利用度,促进SV的成骨效应,为临床骨组织再生提供更好的解决方法和理论基础。研究目的：1.研究纳米结构脂质载体载SV的生物学特性,尝试寻找提高SV生物利用度的理想剂型；2.研究纳米结构脂质载体载SV较单纯的SV药物是否具有更优的体内外促成骨能力及其可能机制。研究内容：第一部分：纳米结构脂质载体载SV的合成、检测及优选1.空白NLC的制备和优选首先,利用微射流机根据组成成分比例的不同制备不同组别的NLCs,即：液态脂质(OA)占总脂质质量的10%、25%和40%,表面活性剂P188占总体积的0、0.2%和0.4%及微射流次数1、2和4次,分17组制备空白NLCs,检测粒径、PI、Zeta电位；并用响应面分析法(box beken design,BBD)优选最佳NLC的制备条件,其中X变量：OA浓度(X1, wt%,0.10 to 0.40)、P188浓度(X2, w/v%,0 to 0.40)、微射流的循环次数(X3,次数,1-4次)；Y变量：粒径(Y1),PI (Y2) and zeta点位(Y3)。2.根据BBD优选的最佳NLCs制备条件,按照三种不同的理论载药量(5%、10%和20%)进行载药,并进行粒度分析、形貌观察、载药量和包封率测量及体外缓释检测。其中,马尔文激光粒度仪检测粒径大小、多分散指数和zeta电位；透射电子显微镜检测形貌；高效液相色谱仪检测药物包封率和载药率；体外缓释实验采用透析法。第二部分：纳米结构脂质载体载SV体外成骨性能及成骨机制的研究1.MG-63细胞的培养取冻存MG-63细胞株复苏,以1×106/ml密度接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基的25 nl培养瓶中,置于37-℃、5% CO2饱和湿度条件下培养。24小时后更换新鲜培养液,除去未贴壁细胞,以后每48-72小时换液,逐日观察、记录其生长、增殖情况。2.纳米结构脂质载体载SV对成骨细胞增殖和分化功能的影响实验组分为：SNs组(2.5×10-9to 2.5×10-6M)、单纯SV组(2.5×10-9to2.5×10-6M)、空白NLC组和空白对照组。分别检测SNs对MG-63细胞的增殖(MTS法),碱性磷酸酶ALP活性,体外矿化能力(茜素红染色法)以及骨钙素的蛋白和mRNA表达的影响。第三部分：纳米结构脂质载体载SV体内成骨性能及成骨机制的研究1.动物模型的建立和标本制取二十只健康新西兰大白兔,雄性,5-6个月龄,由广东省实验动物检测所供。严格按照无菌操作流程进行,麻醉后常规消毒铺巾,颅顶垂直切口,翻粘骨膜全厚瓣,骨动力系统制备4个直径为8mm的环形颅骨标准骨缺损,下方至硬脑膜。随机分为四组：SNs(含0.5mg SV)混合骨粉组、0.5 mg单纯SV混合骨粉组、骨粉组和空白对照组。分别将SNs(含0.5mg SV)混合骨粉、0.5 mg单纯SV混合骨粉和骨粉植入环形颅骨标准骨缺损内,分层缝合。术后使用3d抗生素。术后4周处死,处死前13-14 d注射四环素,3-4 d注射钙黄绿素。骨动力系统切取完整的颅骨并修整边缘,备用。2.组织学分析对骨缺损修复区及邻近骨组织行组织学、组织形态学及免疫组织化学分析。一半样品行脱钙处理,制作石蜡切片,行HE染色、ALP染色、Masson染色和OC免疫组织化学染色。显微镜下拍摄组织学照片后,利用IPP软件对新生骨面积百分比进行测量。光学显微镜下观察ALP染色阳性细胞及OC染色阳性细胞并计数。另一半样品制作硬组织切片,共聚焦显微镜下观察骨缺损内双荧光标记的骨组织再生情况,并用图像测量软件进行测量；通过甲苯氨蓝染色法进一步观察不同组别间的新骨再生情况。统计分析：采用SPSS 19.0统计分析软件进行数据分析。数据结果用x±s表示。数据采用单因素方差分析(ONE WAY ANOVA)或析因设计资料的方差分析,对资料行正态性检验分析及Levene's test检验方法行方差齐性检验,若方差齐且检验结果存在统计学差异者,则组间进一步行两两比较(Bonferroni检验方法);若方差不齐,则采用近似F检验Welch法,检验结果存在统计学差异时,进一步行多重比较(Dunnett's T3法)。若资料不符合正态分布,数据分析采用非参数的Kruskal-Wallis H检验,若检验结果存在统计学差异,则组间进一步行Mann-Whitney U检验。检验标准a=0.05。研究结果：1.本研究中,采用微射流法成功制备了SNs,采用三因素、三水平星点设计分析并优化出最佳制备条件为OA浓度为40%(wt%),P188表面活性剂浓度为0.4%(w/v%),微射流机循环次数为4次。依据响应面分析的最佳制备条件,我们采用微射流法成功制备出了三种理论载药量条件下的SNs (SV/NLC, wt%),平均粒径为174.7nm,包封率高达94.1%,实际载药率可达18.2。体外缓释实验结果表明SNs释放SV较单纯的SV有明显的控释效果。2.为了验证SNs具有良好的生物学作用,本课题进行了体外细胞摄取实验和增殖分化检测实验。通过细胞摄取实验,结果发现纳米载药进入成骨细胞是通过内吞作用完成,细胞内的荧光颗粒在37℃条件下会随着浓度和时间的增加而增加。细胞增殖实验结果表明,SNs相比单纯的SV更能够有效的促进细胞的增殖,且存在时间和剂量依赖性,在低浓度条件下会促进细胞增殖,而高浓度条件下存在轻微抑制现象,且高浓度的抑制作用可以通过纳米载药的缓控释作用来减小。另外,细胞分化实验结果表明,SNs能更好的促进碱性磷酸酶活性的表达、矿化结节的形成及相关成骨蛋白和成骨基因的表达。其中以含2.5×10-7 M和2.5×10-8M SV的SNs组效果最佳。3.为了研究SNs的体内稳定性、宿主反应性及早期的体内促成骨能力,本研究制备了兔颅骨标准骨缺损模型。组织学、免疫组织化学和组织形态学检测结果证明含0.5 mg SV的SNs组能更好的促进新骨形成、有更多的骨胶原和成骨细胞表达。组织形态学分析显示,对照组的新生骨面积比为4.13±0.17%,当加入了0.5 mg SV药物时,新生骨面积比增加到10.38±0.52%,当加入了含有0.5 mg SV的纳米粒子时,新生骨面积比增加到16.26±0.59%,在没有炎症的情况下4周时在骨缺损处产生了大量的新骨。此外,组织学和荧光显微镜分析结果表明,4周时各个组都有不同程度的不规则新骨形成,大部分位于骨缺损的边缘,少量位于骨缺损的中心。Masson三色染色结果表明,局部应用SNs可显著增加骨缺损区早期骨胶原的再生和新生血管的形成。本研究还发现,SNs可促进OC蛋白的表达,且免疫组织化学分析显示新生骨的量与OC阳性细胞的数目成正比,在SNs组中比SV组中OC阳性细胞显著增加,且四周时差异有统计学意义(P=0.000)。结论：1.微射流法可成功制备出高包封率和载药率的载SV的纳米结构脂质载体,同时具有较好的理化性能和良好的缓释效果；2.纳米结构脂质载体载SV相比单纯的SV更能够有效的促进细胞的增殖和分化；该研究结果证实了纳米结构脂质载体载SV可通过类似于SV促进成骨细胞增值和分化的作用机制来促进成骨作用,但有关纳米载药促进成骨作用的具体机制需要更进一步的研究。3.含0.5 mg SV的纳米结构脂质载体载SV组能更好地促进兔颅骨标准骨缺损状态下的新骨形成。
【关键词】：纳米结构脂质载体 辛伐他汀 骨再生 标准骨缺损
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R783.6
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-22
• 第一章 绪论22-37
• 1.1 口腔种植领域骨组织再生的研究22-27
• 1.2 辛伐他汀成骨作用的研究27-30
• 1.3 纳米结构脂质载体的概述30-35
• 1.4 相关课题思路35-36
• 1.5 课题的研究目的和内容36-37
• 第二章 微射流均质法制备纳米结构脂质载体载辛伐他汀37-52
• 2.1 仪器与材料37
• 2.2 实验方法37-41
• 2.3 实验结果41-47
• 2.4 讨论47-50
• 2.5 小结50-52
• 第三章 纳米结构脂质载体载辛伐他汀体外成骨性能及成骨机制的研究52-83
• 3.1 仪器和材料52-55
• 3.2 实验方法55-67
• 3.3 实验结果67-80
• 3.4 讨论80-81
• 3.5 结论81-83
• 第四章 纳米脂质载体载辛伐他汀体内成骨性能及成骨机制的研究83-115
• 4.1 实验试剂材料、仪器、手术器械83-88
• 4.2 实验方法88-102
• 4.3 实验结果102-111
• 4.4 讨论111-114
• 4.5 结论114-115
• 参考文献115-129
• 全文总结129-131
• 中英文缩略词表131-132
• 论文成果132-133
• 致谢133-135

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