pCAMBIA-E8-APB-DOCK8融合基因表达质粒中标记基因的去除及瞬时转化番茄的研究

发布时间：2017-09-04 15:28

  本文关键词：pCAMBIA-E8-APB-DOCK8融合基因表达质粒中标记基因的去除及瞬时转化番茄的研究

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【摘要】：龋病(dental caries),俗称虫牙或蛀牙。它是牙体硬组织发生的慢性、进行性破坏的疾病。其具有发病率高、分布广等特点,目前已严重影响到了人们的生活质量。因此,需要寻找一种能有效降低患龋率的方法已成为当今研究的热点。变异链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)是人类最主要的致龋菌,其中主要的致龋毒力因子是表面蛋白(surface protein antigen,PAc)和葡糖基转移酶(glucosyltransferases,GTFs),研究表明针对这两种致龋毒力因子的抗体,可以有效抑制龋病的发生和发展。因此,“免疫防龋”可成为当今有效控制龋病的方法。本课题组针对这两种毒力因子,成功构建了植物表达载体p CAMBIA-E8-APB-DOCK8(简称p E8AD3),并转化番茄获得转基因番茄植株。转基因植物的食用安全和生态安全受到了人们的广泛关注,目前转基因植物的首要安全问题来源于标记基因的存留,将标记基因去除可消除人们对安全性的顾虑。本实验作为课题组实验的延续,将融合基因表达质粒p E8AD3中的标记基因Km和GUS去除,并进一步探索番茄瞬时转化表达系统,为后续蛋白水平的研究提供实验基础。目的:以课题组构建的质粒pE8AD3为基础,将选择标记基因Km和GUS去除,为后期番茄再生转化提供实验基础,提高转基因植物的安全性。利用农杆菌介导的注射法,建立番茄子叶瞬时表达系统,分析外源基因的表达情况。方法:1、运用DNA重组技术,将p E8AD3中的选择性标记基因Km和GUS去除。2、通过对番茄无菌苗的培育,观察不同番茄品种的出芽数、成苗数及农艺学性状的差异显著性,筛选出适用于本实验的番茄品种;将重组质粒p E8AD3转化农杆菌EHA105,通过对番茄子叶、注射农杆菌浓度、农杆菌注射量、生长苗龄以及共培养天数进行筛选,建立农杆菌介导的番茄子叶瞬时表达系统,观察DOCK8基因的表达情况。3、番茄再生转化中,通过对番茄子叶外植体的培育,侵染农杆菌后的抑菌实验,观察羧苄青霉素、头孢霉素、特美汀3种抗生素在不同抑菌浓度下的抑菌效果及外植体形态的变化,确立抑菌抗生素及浓度;运用PCR检测方法,对课题组获得的转基因番茄果实进行初步筛选。结果:1、成功获得不含标记基因Km和GUS的重组质粒p E8AD3。2、建立番茄子叶瞬时表达系统,适合本实验的番茄品种为欧洲大红(苹果型),选材部位为番茄的子叶,注射农杆菌浓度为OD600为0.2-0.7,农杆菌注射量为50μL,苗龄为7-10 d,共培养24-48 h。3、番茄再生转化中,特美汀作为一种有效抑制农杆菌的抗生素,抑菌效果显著,对植物影响小,特别适用于较难转化的材料的转基因过程,抑菌浓度为400 mg/L为宜,抑菌浓度过大或过小均会影响外植体的生长;PCR筛选出阳性番茄果实并保种。结论:1、获得了可用于植物遗传转化的不含Km和GUS选择标记基因的融合基因表达载体p E8AD3,该载体含有果实特异性启动子E8,APB中包含cat、Pac A和ctx B基因,以及胞质分裂专一蛋白8(DOCK8)。2、建立并优化农杆菌介导的番茄子叶瞬时表达系统,该系统的优点是操作简单,不需要昂贵的试剂和仪器,在短时间内可分离蛋白,为进一步探索目的蛋白的生物学功能提供实验基础,为后期外源基因蛋白表达分析的研究提供一种方便、快捷和有效的方法。3、优化出浓度为400 mg/L的特美汀抗生素作为番茄(欧洲大红)转基因选择压,该抗生素与其他抗生素相比,其优点是能有效抑制农杆菌的生长,对植物影响小,特别适用于较难转化的材料的转基因过程,尤其是农杆菌OD值较高,很难被其他抗生素抑制时效果较为理想。4、获得含GUS报告基因的转基因(p E8AD3)阳性番茄果实,并成功用于种子的保存和繁育。
【关键词】：龋病 变异链球菌 标记基因 番茄 瞬时表达
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R781.1
【目录】：

• 中英缩略词对照表7-8
• 中文摘要8-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-16
• 第一章 载体p E8AD3中选择标记基因的去除16-35
• 1 仪器和材料16-19
• 1.1 主要仪器16
• 1.2 材料16-19
• 1.2.1 菌种和质粒16-18
• 1.2.2 LB培养基18
• 1.2.3 抗生素18-19
• 1.2.4 实验试剂盒19
• 1.2.5 限制性内切酶及DNA连接酶19
• 1.2.6 其他19
• 2 实验方法19-28
• 2.1 实验技术路线19-28
• 2.1.1 实验方法21-28
• 3 结果28-31
• 3.1 p E8AD3质粒抽提、PCR及酶切结果28-30
• 3.2 测序结果30-31
• 4 讨论31-35
• 4.1 选择性标记基因去除的目的及意义31-32
• 4.2 融合基因表达质粒中标记基因去除的方法32
• 4.3 标记基因去除时的实验操作32-33
• 4.4 研究现状及展望33-35
• 第二章 农杆菌介导的番茄子叶瞬时表达35-53
• 1 仪器和材料35-36
• 1.1 主要仪器35
• 1.2 材料35-36
• 1.2.1 植物材料35
• 1.2.2 质粒及菌种35
• 1.2.3 培养基35-36
• 1.2.4 抗生素36
• 1.2.5 生物素36
• 1.2.6 生化试剂盒36
• 1.2.7 其他36
• 2 实验方法36-40
• 2.1 实验技术流程36-37
• 2.2 实验方法37-40
• 2.2.1 无菌苗的培育37-38
• 2.2.2 重组质粒p E8AD3转化农杆菌EHA10538
• 2.2.3 农杆菌转化液的制备38
• 2.2.4 番茄子叶注射及共培养38-39
• 2.2.5 番茄子叶总RNA的提取39
• 2.2.6 RNA逆转录c DNA39-40
• 2.2.7 PCR检测不同条件下番茄子叶瞬时表达情况40
• 3 结果40-49
• 3.1 无菌苗的生长过程40-42
• 3.2 统计学分析42-43
• 3.3 p E8AD3转化农杆菌EHA105及PCR鉴定结果43-44
• 3.4 m RNA水平检测DOCK8在番茄中的表达44-49
• 4 讨论49-53
• 4.1 瞬时表达研究的目的和意义49-50
• 4.2 瞬时表达外源基因的方法50
• 4.3 结果与分析50-52
• 4.4 研究现状及展望52-53
• 第三章 不同抗生素和浓度对番茄外植体的影响及转基因番茄果实的初步筛选53-68
• 1 仪器和材料53-54
• 1.1 主要仪器53
• 1.2 材料53-54
• 1.2.1 植物材料53
• 1.2.2 质粒及菌种53
• 1.2.3 培养基53-54
• 1.2.4 抗生素54
• 1.2.5 其他54
• 2 实验方法54-57
• 2.1 农杆菌介导的外源基因转化番茄的研究54-55
• 2.1.1 重组质粒p E8AD3转化农杆菌EHA10554
• 2.1.2 外植体的预备54-55
• 2.1.3 侵染55
• 2.1.4 共培养55
• 2.1.5 抑菌浓度的确立55
• 2.2 番茄果实的初步筛选55-57
• 2.2.1 植物基因组提取55-56
• 2.2.2 GUS检测56-57
• 3 结果57-66
• 3.1 番茄外植体预培养57-58
• 3.2 抑菌抗生素及培养基浓度的确立58-59
• 3.3 转基因番茄生长过程59-61
• 3.4 植物组DNA提取、GUS检测结果61-66
• 4 讨论66-68
• 4.1 抗生素的选择及抑菌浓度确立的目的和意义66
• 4.2 不同抗生素抑菌效果分析66-67
• 4.3 检测方法67-68
• 结论68-69
• 附录 169-70
• 附录 270-77
• 参考文献77-82
• 综述（一）82-94
• 参考文献90-94
• 综述（二）94-106
• 参考文献102-106
• 致谢106-107
• 作者简介107-108

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本文编号：792343