miR-345-3p在周期性牵张力诱导大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的生物学功能

发布时间：2017-09-07 09:16

  本文关键词：miR-345-3p在周期性牵张力诱导大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的生物学功能

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【摘要】：背景机械力诱导的牙槽骨改建是正畸牙移动最重要的生物学基础理论之一。机械力激活细胞进行骨改建的机制不仅是正畸领域的研究重点,也是口腔颌面外科、骨科等领域学者们关注的焦点。体内和体外实验以及临床应用都发现在正畸牙齿移动、牵张成骨、骨折修复等过程中,适当的牵张力能刺激骨组织的生长与改建。在此过程中,骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)受到张应力的作用,向牵张区趋化、增殖、成骨分化,是新骨形成的细胞学基础,是维持骨骼系统稳定的关键环节。微小RNA(MicroRNA, miRNA);是一类由20-24个核苷酸构成的负性调控基因表达的非编码单链RNA分子,普遍存在于各类生物体内。通过microRNA来抑制mRNA翻译已被发现是一个重要的调节骨形成的信号通路。已有大量研究表明,miRNA与BMSCs的成骨分化有密切的关系。然而以往对于牵张力作用下参与BMSCs成骨分化的miRNA少有系统而深入的研究。本课题组在前期实验中通过高通量基因芯片检测技术检测了周期性牵张力刺激12小时与未受机械力刺激的大鼠BMSCs的miRNA基因表达谱,筛选出了一系列牵张力刺激前后差异表达的miRNA并对这些miRNA进行了验证。本实验从中选取表达量显著降低的miR-345-3p来进行研究,验证其在周期性牵张力诱导的大鼠BMSCs成骨分化中所发挥的生物学作用,并利用生物信息学方法对miR-345-3p作用的靶基因进行预测。目的探讨并验证miR-345-3p在周期性牵张力诱导大鼠BMSCs成骨分化过程中的生物学作用,并通过生物信息学研究方法来预测其可能的靶基因。从microRNA的角度初步探索牵张力诱导BMSCs成骨分化的机制,为正畸骨改建及牵张成骨技术提供理论依据以及为寻求牵张力条件下口腔诊治的新策略提供理论和实验依据。方法1.大鼠BMSCs的体外分离培养和鉴定：全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs,倒置显微镜下观察其生物学形态,CCK-8法检测其增殖能力；并对其进行成骨、成脂诱导,应用茜素红染色、ALP染色、油红O染色法证实其可以分化为成骨细胞及成脂肪细胞；流式细胞术鉴定细胞表面抗原。2.观察周期性牵张力作用下大鼠BMSCs内ALP活性、成骨相关基因及miR-345-3p随时间的表达情况：按加载时间将大鼠BMSCs分为4组一--Oh、3h、6h、12h,对各组施以牵张力刺激(1Hz、10%拉伸强度)。通过ALP活性检测及RT-PCR检测周期性牵张力作用下大鼠BMSCs ALP活性及Runx2、Osterix、miR-345-3p随时间变化的表达情况。3.观察miR-345-3p在周期性牵张力诱导大鼠BMSCs成骨分化中的作用：采用细胞转染技术过表达和抑制miR-345-3p在大鼠BMSCs中的表达水平,加载周期性牵张力(1Hz、10%拉伸强度)3h,通过RT-PCR、Western blot检测大鼠BMSCs成骨分化相关标志物的表达水平,研究miR-345-3p在周期性牵张力诱导大鼠BMSCs成骨分化中的生物学功能。4.通过靶基因预测软件和生物信息学网站筛选miR-345-3p的候选靶基因。结果1.经全骨髓贴壁法所获得的细胞符合BMSCs的特征,流式细胞仪检测其表面抗原分子CD44、CD90为阳性,CD34、CD45为阴性,经体外诱导可分化为成骨细胞及成脂肪细胞。2.大鼠BMSCs加载周期性牵张力(1Hz,10%拉伸强度)0、3、6、12小时后,随加力时间延长,ALP活性逐渐增强且受力后即明显升高(P0.05): Runx2 mRNA、Osterix mRNA表达逐渐升高且分别于受力3小时和6小时后升高明显(P0.05); miR-345-3p的表达逐渐降低,于3小时达低谷(P0.01),之后逐渐升高,但仍低于对照组表达水平。3.上调miR-345-3p的表达水平可显著降低周期性牵张力诱导的大鼠BMSCs的成骨分化能力,RT-PCR结果表明miR-345-3p mimic组较其对照组ALP、Runx2、 Osterix表达均减少(P0.05); Western blot结果显示miR-345-3p mimic组较其对照组ALP及Runx2表达明显减少。下调miR-345-3p的表达可增加大鼠BMSCs的成骨能力,RT-PCR结果表明miR-345-3p inhibitor组较其对照组ALP、Runx2、 Osterix表达均增强(P0.05); Western blot结果表明inhibitor组较其对照组ALP及Runx2表达明显增加。4.生物信息学预测Hoxa2、IGF2、CBFB、BCL2、AXIN2、FN1等为miR-345-3p的候选靶基因。结论1.采用全骨髓贴壁法可分离得到较纯的大鼠BMSCs,并且在体外经过诱导可分化为成骨细胞及成脂肪细胞。2.周期性牵张力刺激(1Hz,10%拉伸强度)可诱导大鼠BMSCs体外成骨分化；miR-345-3p对牵张力刺激敏感,在细胞水平上证明miR-345-3p参与了周期性牵张力诱导的大鼠BMSCs成骨分化。3.miR-345-3p在周期性牵张力诱导的大鼠BMSCs成骨分化中发挥负向调控作用。4.本研究有利于更全面地理解正畸骨改建及牵张成骨的机制,为临床实践提供理论依据。
【关键词】：miR-345-3p 成骨分化 周期性牵张力 骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymalstem cells BMSCs)
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R783.5
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符号说明13-14
• 前言14-17
• 实验一：大鼠BMSCs的分离培养及干性鉴定17-23
• 一、材料与方法17-18
• 二、实验方法18-21
• 三、结果与分析21-23
• 实验二：miR-345-3p在周期性牵张力诱导大鼠BMSC成骨分化过程中的表达变化23-32
• 一、材料与方法23-24
• 二、实验方法24-30
• 三、结果与分析30-32
• 实验三：miR-345-3p在周期性牵张力诱导大鼠BMSCs成骨分化中的功能及其靶基因预测32-40
• 一、材料与方法32-33
• 二、实验方法33-38
• 三、结果与分析38-40
• 讨论40-45
• 结论45-46
• 附图表46-55
• 参考文献55-60
• 致谢60
• 攻读学位期间发表的学术论文目录60-61
• 学位论文评阅及答辩情况表61

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本文编号：808678