肿瘤坏死因子alpha对成牙骨质细胞矿化、分化、凋亡等的影响及其信号转导机制研究

发布时间：2017-09-13 01:08

  本文关键词：肿瘤坏死因子alpha对成牙骨质细胞矿化、分化、凋亡等的影响及其信号转导机制研究

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【摘要】：牙骨质是覆盖于牙根表面的类似于骨组织样的薄层矿化组织。一方面,牙骨质包绕于牙本质表面,使得牙髓组织免受外界刺激的干扰；另一方面,牙周膜纤维借助对牙骨质的附着从而将牙齿固定于牙槽窝内,故完整的牙骨质结构的维持是牙齿稳定和牙髓组织健康的关键因素之一。正畸诱导性炎症性牙根吸收(OIIRR)是正畸治疗过程中十分常见的临床问题,主要以牙骨质等牙体组织的破坏以及牙骨质修复不足为特征,严重者可导致牙齿的松动度增加甚至脱落。值得注意的是,除了正畸过程外,牙骨质破坏的现象也常见于牙周炎患者。更为有趣的是,根据以往文献报道在正畸矫治力作用和牙周炎条件下均存在牙周组织中TNF-α表达水平显著上调的现象。基于以上有趣的临床现象和文献依据我们提出TNF-α可能是正畸矫治力和牙周炎条件下引发牙骨质破坏的关键途径。本研究拟探讨TNF-α对成牙骨质细胞矿化、分化、凋亡、增殖等方面的影响及其内在信号转导机制,以期为深入认识正畸矫治力作用和牙周炎条件下牙骨质代谢失衡的机理提供新的研究证据。具体研究内容包括以下三个部分：第一部分TNF-α对成牙骨质细胞矿化能力的影响目的：探讨不同浓度TNF-α对成牙骨质细胞矿化能力的影响。方法：将永生化的小鼠成牙骨质细胞系OCCM-30以7.5X104/孔接种于24孔细胞培养板,采用含50 μg/ml维生素C、10mMβ-甘油磷酸钠的矿化诱导液矿化诱导,同时给予不同浓度(0、1、10、20、30、40 ng/ml)的TNF-α处理。连续培养10天后进行茜素红染色,并通过矿化结节定量试剂氯化十六烷基氨基吡啶溶解矿化结节后于酶标仪上562nm波长处读数,以对矿化结节形成量作半定量分析。结果：Ong/mlTNF-α处理组有大量的矿化结节形成；与Ong/mlTNF-α处理组相比所有含TNF-α处理组矿化结节形成量均减少,且随着TNF-α浓度的升高矿化结节形成量越少。结论:TNF-α能够明显抑制成牙骨质细胞的矿化结节形成能力,且浓度越高抑制作用越明显。第二部分TNF-α对成牙骨质细胞分化、凋亡和增殖的影响目的：研究TNF-α对成牙骨质细胞分化、凋亡和增殖的影响方法：(1)采用含50 μ g/ml维生素C、10mMB-甘油磷酸钠的矿化诱导液矿化诱导成牙骨质细胞系OCCM-30,同时给予不同浓度(0、1、10、20、30、40 ng/ml)的TNF-α处理,连续培养7天后进行ALP活性检测；(2)使用不同浓度的TNF-α (0、1、10、20、30、40ng/ml)刺激成牙骨质细胞系OCCM-30一定时间,或使用20 ng/mlTNF-α刺激OCCM-30不同时间长度(0-24小时),通过real-time PCR、 western blot的方法检测osterix、BSP、OCN、cleaved caspase-3等的表达变化；(3)使用不同浓度的TNF-α(0、 1、10、20、30、40 ng/ml)刺激成牙骨质细胞系OCCM-3024小时,通过流式细胞术检测细胞凋亡比例的变化。结果：(1)不同浓度的TNF-α均能够降低成牙骨质细胞系OCCM-30的ALP活性,且TNF-α浓度越高,对ALP活性的抑制作用也越明显；(2)不同浓度TNF-α均能够降低成牙骨质细胞系OCCM-30中osterix的转录和蛋白表达水平,且浓度越高抑制作用越明显；20 ng/mlTNF-α在0-24小时的时间范围内能够抑制成牙骨质细胞系OCCM-30中osterix的转录和蛋白表达水平,且随着时间的延长抑制作用越明显；不同浓度(0-40ng/ml)的TNF-α作用24小时后均能够降低成牙骨质细胞系OCCM-30中BSP、OCN的mRNA表达水平,且浓度越高抑制作用越明显；(3)不同浓度(0-40ng/ml)的TNF-α作用24小时后均能够显著上调成牙骨质细胞系OCCM-30中cleaved caspase-3的表达水平,且浓度越高上调作用越明显；20 ng/mlTNF-α在0-24小时的时间范围内能够显著上调成牙骨质细胞系OCCM-30中cleaved caspase-3的表达水平,且随着时间的延长上调作用越明显；(4)流式细胞术结果表明不同浓度(0-40ng/ml)的TNF-α作用24小时后均能够显著上调成牙骨质细胞系OCCM-30的凋亡细胞比例,且浓度越高上调作用越明显。结论：TNF-α能够抑制成牙骨质细胞的分化、促进成牙骨质细胞的凋亡,且均表现出严格的浓度和时间依赖性。第三部分TNF-α调控成牙骨质细胞分化和凋亡的信号转导机制研究目的：探讨p53、PP2Ac、Erk1/2、p38、JNK、PI3K-Akt以及NF-κB等信号通路在TNF-α调控成牙骨质细胞分化和凋亡过程中的作用。方法：(1)使用TNF-α刺激体外培养的成牙骨质细胞系OCCM-30,利用real-time PCR, western blot检测p53、MDM2、p21、PP2Ac alpha、PP2Ac beta, p-Erk1/2、 Erk1/2、p-p38、p38、p-JNK、JNK、p-Akt、Akt、p-p65、p65等的表达变化；(2)采用p53特异性化学阻断剂PFT-α、P53 siRNA或PP2Ac特异性化学阻断剂OA预处理细胞,并在TNF-α (20ng/ml)刺激成牙骨质细胞24小时后通过real-time PCR, western blot的方法检测osterix、cleaved caspase-3等的表达水平；(3)采用p38通路阻断剂SB203580、Erk1/2通路阻断剂PD98059、JNK通路阻断剂SP600125、PI3K-Akt通路阻断剂LY294002、NF-κB通路阻断剂PDTC预处理细胞,并在TNF-α (20ng/ml)刺激24小时后通过real-time PCR、western blot的方法检测osterix、cleaved caspase-3等的表达水平；(4)采用p38、Erk1/2、 JNK、PI3K-Akt、NF-κB等信号通路阻断剂预处理细胞,并在TNF-α (20ng/ml)刺激24小时后通过real-time PCR、western blot的方法检测成牙骨质细胞中p53、MDM2等的表达水平。结果：(1) TNF-α能够增强p53、MDM2、p21、PP2Ac alpha、PP2Ac beta等的表达水平：TNF-α能够显著增强p-Erk1/2、p-p38、p-JNK、p-Akt、p-p65的表达而Erk1/2、p38、JNK、Akt、p65的表达则无明显变化；(2)使用p53阻断剂PFT-α或p53 siRNA预处理细胞后,与单纯TNF-α处理组相比,osterix的表达水平上升而cleaved caspase-3的表达水平下降；使用PP2Ac阻断剂OA预处理细胞后,与单纯TNF-α处理组相比,osterix的表达水平无明显变化而cleaved caspase-3的表达呈现无规律波动；(3)采用p38、Erk1/2、JNK、PI3K-Akt、NF-κB等信号通路阻断剂预处理细胞后,与单纯TNF-α处理组相比,osterix的表达水平被更为强烈地抑制而cleaved caspase-3则被更为强烈地上调；(4)采用p38、Erk1/2、JNK、PI3K-Akt等信号通路阻断剂预处理细胞后,p53和MDM2的表达水平较单纯TNF-α刺激时有了进一步的上升；与以上阻断剂处理组相反,采用NF-κB阻断剂预处理细胞后p53和MDM2的表达水平较单纯TNF-α刺激时下降。结论：(1)在成牙骨质细胞中p53、PP2Ac、Erk1/2、p38、JNK、PI3K-Akt以及NF-κB等信号通路均能够被TNF-α激活；(2)p53能够介导TNF-α对成牙骨质细胞的分化抑制和凋亡诱导作用；(3)与p53的作用相反,Erk1/2、p38、JNK、 PI3K-Akt以及NF-κB等信号通路在被TNF-α激活后负反馈调控TNF-α对成牙骨质细胞的分化抑制和凋亡诱导作用；(4) Erk1/2、p38、JNK、PI3K-Akt信号通路依赖或至少部分依赖它们对p53的调控作用来实现对TNF-α抑制成牙骨质细胞分化、促进凋亡过程的负反馈调节作用；然而NF-κB信号通路并不依赖p53来实现其对TNF-α抑制成牙骨质细胞分化、促进凋亡过程的负反馈调节作用。
【关键词】：正畸诱导性炎症性牙根吸收 肿瘤坏死因子alpha 成牙骨质细胞 信号转导
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R783.5
【目录】：

• 论文创新点6-7
• 英文缩略词表7-10
• 中文摘要10-14
• 英文摘要14-19
• 引言19-21
• 综述21-29
• 正文29-87
• 第一部分 TNF-α对成牙骨质细胞矿化能力的影响30-38
• 1 材料和方法31-35
• 2 实验结果35-36
• 3 讨论36-37
• 4 总结37-38
• 第二部分 TNF-α对成牙骨质细胞分化、凋亡和增殖等的影响38-60
• 1 材料和方法40-54
• 2 实验结果54-55
• 3 讨论55-59
• 4 总结59-60
• 第三部分 TNF-α调控成牙骨质细胞分化和凋亡的信号转导机制研究60-77
• 1 材料和方法62-65
• 2 实验结果65-75
• 3 讨论75-76
• 4 结论76-77
• 附图77-87
• 参考文献87-107
• 个人简历107-108
• 致谢108-110

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本文编号：840613