腺病毒介导的钙粘蛋白11基因转染大鼠牙髓细胞的实验研究

发布时间：2017-09-13 17:24

本文关键词：腺病毒介导的钙粘蛋白11基因转染大鼠牙髓细胞的实验研究

【摘要】：目的：1.分离、培养及鉴定大鼠牙髓细胞,并建立高效稳定的大鼠牙髓细胞培养方法。2.构建cadherin11腺病毒载体(Ad-Cadherin11),并以此转染大鼠牙髓细胞(rat dental pulp cells),检测cadherin11的表达,探讨腺病毒介导的钙粘蛋白11 (Ad-Cadherin11)转染对体外培养的大鼠牙髓细胞生长的影响,为进一步研究cadherinll基因的功能奠定基础。方法：1.大鼠牙髓细胞的分离、培养及鉴定：脱颈处死2月龄wistar大鼠,在无菌条件下劈开牙冠取大鼠的牙髓组织,并且切除根尖处约1mm左右的牙髓组织,将剩余牙髓组织剪成约1mm3左右,放入培养瓶并以1cm的间距均匀铺于瓶底,加入含200ml/L胎牛血清的DMEM培养液,37℃、5% CO2条件下培养。细胞融合约为80～90%时,用0.25%的胰蛋白酶消化传代细胞,观察细胞形态、大小、贴壁及生长情况。取第3代大鼠牙髓细胞,收集细胞样品,石蜡包埋,并进行波形丝蛋白、角蛋白免疫细胞化学染色,光镜下观察。2.Ad-cadherin11转染大鼠牙髓细胞的实验研究：cadherin11载体构建、293细胞扩增复制重组腺病毒,测定病毒滴度。体外分离培养大鼠牙髓细胞,转染病毒,荧光显微镜下观察转染效果,并以细胞计数法检测病毒转染效率。对转染cadherin11目的基因后的大鼠牙髓细胞进行形态学观察,细胞计数法分析转染后大鼠牙髓细胞的体外增殖情况,绘制生长曲线,并用免疫细胞化学及半定量逆转录聚合酶链(RT-PCR)检测目的基因cadherin11的表达。结果：1.大鼠牙髓细胞的分离、培养及鉴定： (1)原代大鼠牙髓细胞呈圆形折光性强的细胞,贴壁后多数呈长梭形、成纤维状,细胞逐渐增殖,呈集落状生长,细胞排列紧密,周边呈短梭形,体积较小,10d左右可单层融合。(2)传代获得的大鼠牙髓细胞大小匀称,均匀铺于培养瓶,为成纤维细胞状,呈极性生长,在体外具有很强的增殖能力,5 d左右即可单层融合。(3)从生长曲线得出,开始两天细胞生长较平缓,增殖慢,三天后细胞迅速增殖,一周后则呈平稳状态,细胞数变化较小甚至逐渐减少,P10代后细胞逐渐老化,群体的倍增时间大约为6.71 h。(4)波形丝蛋白染色呈阳性反应,而角蛋白染色则呈阴性反应,这些均说明所培养得细胞是来源于中胚层的牙髓细胞。2.Cadherin11转染大鼠牙髓细胞的实验： (1)成功构建了Cadherin11腺病毒表达载体,测得病毒滴度均为：1X1010TU/ml。 (2) Cadherin11基因成功转染大鼠牙髓细胞,在感染复数(MOI)为50时转染大鼠牙髓细胞效率达到最高,病毒转染牙髓细胞48h后,可看到超过70%的大鼠牙髓细胞出现荧光表达。 (3)从生长曲线得出,实验组(Ad-cadherin11)与对照组(Ad-EGFP)及空白对照组相比,发现cadherin11目的基因对牙髓细胞生长有明显促进作用。(4)免疫细胞化学及RT-PCR均检测出携目的基因实验组细胞均显示阳性反应及高表达。结论：1.从大鼠牙髓组织中分离、培养获得的大鼠牙髓细胞,其在体外环境中仍具有较强的增殖能力,并且细胞可长期传代而不会影响其稳定生长,为cadherin11转染大鼠牙髓细胞的实验奠定了基础。2.成功构建了Cadherin11腺病毒表达载体,AD-cadherin11转染大鼠牙髓细胞后,对细胞生长有明显的促进作用。
【关键词】：牙髓细胞 腺病毒载体 基因转染 生长曲线 免疫细胞化学 RT-PCR
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R780.2
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