miR-210诱导犬BMSCs成血管及成骨向分化的体外实验研究

发布时间：2017-09-14 18:37

  本文关键词：miR-210诱导犬BMSCs成血管及成骨向分化的体外实验研究

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【摘要】：目的应用基因转染技术,体外检测miR210基因诱导犬骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨和成血管方向分化的作用,探索目的基因双重调控作用,为将来修复骨缺损打下基础。方法体外培养骨髓间充质干细胞,流式细胞术检测BMSCs表面标志物;构建慢病毒载体Lenti-miR-210和Lenti-Lac Z,并分别用Lenti-Lac Z和Lenti-miR-210转染BMSCs,并在转染后的3~5d在倒置荧光显微镜下观察病毒转染效率;应用MTT法检测病毒对BMSCs增殖率的影响,并在目的基因转染BMSCs的第0天、第1天、第4天、第7天、第14天和第21天分别提取m RNA和蛋白,利用RT-PCR和Western blot检测关键性成血管和成骨因子的表达。同时目的基因转染第21天,通过碱性磷酸酶(ALP)和钙结节茜素红染色观察体外骨形成的情况。检测结果均以均数±标准差表示,使用SPSS统计软件对数据进行分析,P0.05为有统计学差异结果倒置相差显微镜下观察细胞形态为梭形,旋涡状生长,流式细胞仪分析显示,BMSCs间充质干细胞表面抗原CD44、CD90高度表达,造血干细胞表面抗原CD34和CD45表达阴性,推断出所培养的细胞为骨髓间充质干细胞。当感染复数(MOI)=10时,BMSCs的转染效率最高,且病毒对BMSCs增殖能力无显著影响,在病毒转染后的5d,倒置荧光显微镜观察,病毒转染效率均在90%以上,MOI=10时,病毒对细胞的增殖无显著影响(P0.05);RT-PCR结果显示,目的基因转染的第4天、第7天、第14天和第21天,miR-210能够显著上调BMSCs关键性成骨和成血管因子的表达(P0.05);Western blot检测结果显示,蛋白表达与m RNA的表达趋势几乎一致。ALP和茜素红钙结节表达的检测结果显示,相较BMSCs组及Lenti-Lac Z/BMSCs组,Lenti-miR-210/BMSCs组ALP和钙结节表达显著提高。结论以慢病毒为载体的miR-210能够成功转染至BMSCs中,并在细胞中能够高效持续的表达成骨、成血管因子。miR-210可以显著促进BMSCs向成骨和成血管方向分化,这为将来的体内实验奠定了基础。
【关键词】：miR-210 BMSCs 基因转染 血管生成 骨形成
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R78
【目录】：

• 中英文缩略词表6-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-11
• 1 前言11-13
• 2 材料与方法13-23
• 2.1 材料13-16
• 2.1.1 材料与设备13-15
• 2.1.2 部分试剂配制及储存方法15-16
• 2.1.3 慢病毒载体构建16
• 2.2 方法16-23
• 2.2.1 犬BMSCs体外培养16-17
• 2.2.2 流式细胞术检测BMSCs表面标志物17
• 2.2.3 犬BMSCs的转染和实验分组17-18
• 2.2.4 MTT法检测病毒对BMSCs增殖率的影响18
• 2.2.5 钙结节的表达检测18
• 2.2.6 行碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP) 染色18-19
• 2.2.7 Matrigel胶成血管实验19
• 2.2.8 RT-PCR测定成骨和成血管相关基因的mRNA的表达19-21
• 2.2.9 Western blot检测成血管和成骨相关蛋白的表达21-23
• 2.3 统计学处理23
• 3 结果23-30
• 3.1 BMSCs形态学观察23
• 3.2 细胞转染效率检测23-24
• 3.3 病毒对BMSCs增值的影响24-25
• 3.4 流式细胞术检测BMSCs表面标志物25-26
• 3.5 ALP和茜素红钙结节表达的检测26-27
• 3.6 miR-210促进的Matrigel胶成管实验结果27-28
• 3.7 miR-210介导的BMSCs成血管及成骨相关因子mRNA的表达28-29
• 3.8 miR-210介导的BMSCs成血管和成骨因子相关蛋白的表达29-30
• 4 讨论30-33
• 5 结论33-34
• 6 参考文献34-38
• 附录38
• 致谢38-40
• 综述40-48
• 参考文献45-48

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