牙囊细胞通过RUNX2-MiR-31-SATB2环路调节牙萌出的机制研究

发布时间：2017-09-15 17:22

  本文关键词：牙囊细胞通过RUNX2-MiR-31-SATB2环路调节牙萌出的机制研究

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【摘要】：颅骨锁骨发育不全(cleidocranial dysplasia,CCD)是一种罕见的常染色体显性遗传病,致病机理主要是位于第6染色体p21位的Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)基因突变,导致RUNX2单倍剂量不足,临床主要表现为骨骼发育不良和牙齿迟萌、阻生等。研究表明,CCD患者RUNX2单倍剂量不足可能会导致牙囊介导的成骨—破骨调节平衡紊乱。RUNX2作为转录抑制因子调节micro RNA-31(mi R-31)的表达,而mi R-31的下游调节因子SATB2与RUNX2存在调节关系,因此,存在RUNX2-mi R-31-SATB2间的生理性调节环路,但是否参与牙囊细胞调节的牙萌出机制尚不清楚。本研究在分析CCD患者牙囊细胞生物学特性的基础上,旨在探讨牙囊细胞RUNX2-mi R-31-SATB2环路对于破骨活性的调控及其对牙萌出的影响。第一部分:颅骨锁骨发育不全患者牙囊细胞的体外分离培养及生物学特性目的:体外分离并培养CCD患者及正常同龄对照组的牙囊细胞(dental follicle cells,DFCs),并对DFCs的生物学特性进行比较分析。方法:利用牙囊组织块贴壁法体外提取并培养DFCs,待细胞自组织块中爬出,形成集落并且当各集落相互接触时进行传代培养;通过细胞免疫荧光鉴定DFCs;采用用结晶紫染液染色培养12 d的两种DFCs,分析其克隆形成能力;MTT法与Brd U细胞增殖实验分析CCD患者及正常同龄对照DFCs的增殖能力;并用成骨诱导液诱导两种DFCs成骨分化,Western blot和茜素红染色法分析成骨能力;实时定量PCR分析破骨激活因子基因表达。结果:(1)CCD患者的DFCs(DFCs-CCD)与正常DFCs(DFCs)无明显的形态学差异,两者的Vimentin均为阳性表达,上皮标记物Cytokeratin均阴性表达。(2)DFCs-CCD的克隆集落多于DFCs,MTT实验中,同一时间点DFCs-CCD的吸光度值高于DFCs,DFCs-CCD的Brd U阳性率高于DFCs。(3)与正常DFCs相比,DFCs-CCD中RUNX2、Osterix、骨钙素(osteocalcin,Ocn)等成骨相关蛋白表达水平低,且形成钙化结节少。(4)DFCs-CCD高表达核因子-κB受体活化因子(receptor activator for nuclear factor-κB,RANK)和骨保护素(osteoprotegerin,OPG)等破骨抑制相关因子(P0.05),而RANK配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)水平无统计学差异(P0.05)。结论:与DFCs相比,DFCs-CCD具有更强的增殖、克隆形成能力,但成骨分化能力较弱,破骨活性抑制因子高表达。第二部分:RUNX2-mi R-31-SATB2调控牙囊细胞参与牙萌出的机制目的:分析RUNX2-mi R-31-SATB2环路对牙囊细胞侵袭、破骨细胞激活功能的影响,探讨该环路参与牙囊细胞调控牙萌出的机制。方法:(1)Western blot、Real-time PCR检测RUNX2、SATB2、mi R-31在DFCs、DFCs-CCD中的表达差异。(2)Transwell穿膜实验比较侵袭能力,并用Western blot及明胶酶谱检测其MMP9、MMP2表达。(3)Real-time PCR检测破骨激活因子表达,并通过牙囊细胞-骨髓细胞共培养诱导破骨,检测其诱导破骨能力差异。(4)通过敲减DFCs-CCD的mi R-31表达,检测其RUNX2、SATB2表达变化及诱导破骨能力的改变;通过过表达DFCs的mi R-31,反向验证RUNX2、SATB2及诱导破骨能力的改变。结果:(1)与DFCs相比,DFCs-CCD中RUNX2、SATB2低表达,而mi R-31高表达。(2)DFCs-CCD穿膜侵袭能力较弱,且MMP9、MMP2表达及活性较低。(3)DFCs-CCD的破骨激活因子表达、诱导破骨能力均较正常DFCs低。(4)DFCs-CCD敲减mi R-31,可以逆转上述结果;相反,DFCs过表达mi R-31,获得与DFCs-CCD相似的结果。结论:CCD患者RUNX2基因突变导致其表达下降,进而导致mi R-31表达升高及其靶基因SATB2表达下调,RUNX2-mi R-31-SATB2可能参与CCD患者恒牙迟萌,操纵RUNX2-mi R-31-SATB2环路有可能促进牙萌出。第三部分:RUNX2-mi R-31-SATB2环路参与牙萌出的动物实验研究目的:通过新生小鼠体内干扰RUNX2表达,探讨RUNX2-mi R-31-SATB2对牙萌出的影响。方法:对出生当日的C57BL/6J小鼠注射体内RUNX2干扰试剂,对实验第8天的小鼠下颌骨标本行免疫荧光检测RUNX2表达;TRAP染色检测牙囊周围活性破骨细胞;并提取牙囊组织的蛋白及RNA,分别检测RUNX2、SATB2蛋白及mi R-31表达。对实验第14天的小鼠行micro CT检测,观察其牙齿萌出情况。结果:(1)体内干扰RUNX2第8天后,牙囊组织中RUNX2及SATB2表达均低于对照组,而mi R-31表达升高。(2)实验组牙囊周围牙槽骨中的破骨细胞明显少于对照组。(3)体内干扰RUNX2第14天后,micro CT结果显示实验组牙齿萌出延迟。结论:体内RUNX2干扰法可以模拟CCD患者的牙萌出,RUNX2-mi R-31-SATB2环路可能是牙囊细胞调节牙萌出的重要生物学机制。
【关键词】：颅骨锁骨发育不全 牙囊 基质金属蛋白酶 miRNAs 破骨细胞
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R780.2
【目录】：

• 英文缩略词表6-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-15
• 第一部分 颅骨锁骨发育不全患者牙囊细胞的体外分离培养及生物学特性15-34
• 1．材料与方法15-27
• 2. 结果27-33
• 3. 讨论33-34
• 第二部分 RUNX2-mi R31SATB2调控牙囊细胞参与牙萌出的机制34-53
• 1. 材料与方法34-42
• 2. 结果42-51
• 3. 讨论51-53
• 第三部分 RUNX2-mi R31SATB2环路参与牙萌出的动物实验研究53-61
• 1. 材料与方法53-56
• 2. 结果56-60
• 3. 讨论60-61
• 全文总结61-62
• 参考文献62-65
• 综述65-73
• 参考文献69-73
• 攻读学位期间发表文章情况73-74
• 致谢74

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本文编号：857883