负载甲状旁腺相关肽的聚乳酸缓释微球体外促成骨作用研究

发布时间：2017-09-16 15:32

  本文关键词：负载甲状旁腺相关肽的聚乳酸缓释微球体外促成骨作用研究

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【摘要】：研究背景及目的： 口腔内种植修复已逐渐成为缺牙患者修复的主要方式之一，种植体的骨整合和长期稳定主要依赖充足的种植体周围骨质量,种植体周围骨组织溶解造城的无菌性松动是种植体失败的普遍原因。骨质疏松患者、牙槽骨局部骨缺损患者以及具有Ⅳ类骨质的患者，进行种植手术时种植体均难以获得最佳固位，大大降低了远期种植成功率。因此，如何在此类患者中增强种植体固位成了亟待解决的问题。 甲状旁腺素(PTH)在人体内由甲状旁腺主细胞分泌，生物活性片段为PTH1-34，可介导成骨细胞合成代谢、刺激骨基质分泌和抑制成骨细胞凋亡，是直接作用于骨和肾脏最重要的钙稳态调节因子。用于骨质疏松及骨折或骨缺损患者可加快其骨修复，改善骨代谢。目前PTH（1-34）多以皮下注射为给药方式，价格昂贵，半衰期短易变性，靶向性较差，给患者带来痛苦和不便。控释技术使生物活性制剂在体内特定时间特定作用点的释放成为可能，将生物活性剂包封进可降解高分子聚合物材料中，可以保护有效成分不被体内的酶降解，并可以控制和延长其释放浓度和持续时间，常用于体内体外传送药物、激素、生长因子等。聚乙交酯-丙交酯（PLGA）因其优良的生物相容性、降解性及给药量的可控性成为理想的给药载体。已经FDA批准作为安全的生物材料应用于临床。本实验通过双乳液法制备了包载PTH（1-34）的PLGA微球，实现对PTH（1-34）的控释，将其与鼠源性成骨细胞系共培养，通过体外细胞学和分子生物学实验拟对该载药材料的促成骨作用效果做出评价。 方法： 将可降解的聚乳酸微球包载甲状旁腺相关肽PTH（1-34），用NaOH-SDS法测定微球的载药量后，用生理盐水配置成终浓度一定（10-9mol/L）的药物控释溶液，将其与诱导分化后的MC3T3-E1细胞共培养，进行ALP（碱性磷酸酶）染色、茜素红染色，观察其分化活性及体外矿化程度，在设定时间点（24h、72h）检测该载药微球对MC3T3-E1细胞RUNX2、ALP和VEGF的mRNA表达的影响。 结果： 1、聚合物微球载药率经测得PLGA微球载药率为0.78%。 2、碱性磷酸酶染色结果成骨诱导液培养72h后铺板染色，细胞内呈现棕黑色的即为碱性磷酸酶活性部位，有的聚集成条块状，实验组及阳性对照组碱性磷酸酶染色程度高于空白对照组，呈强阳性。 3、茜素红染色结果成骨诱导液培养至28d时，镜下见细胞呈现复层生长，局部钙盐沉积处形成结节。茜素红染色显示:间歇给药组（b组）和载药微球组（e组）钙结节直径明显较空白对照组（a组）大（P0.05），未载药微球组（d组）钙结节较少，，持续性给药组（c组）未见钙结节。 4、成骨相关基因表达分析将各组细胞进行成骨诱导24h、72h后，PCR检测结果显示：RUNX2和ALP第三天的表达趋势整体较第一天高，其中间歇给药组（b组）和载药微球组（e组）又明显高于空白对照组(a组（)P0.05），ALPmRNA的表达趋势与ALP染色结果一致；VEGF第一天表达较高，第三天有所下降，但实验组(e组)表达量始终高于空白组（P0.05），与阳性对照组（b组）表现一致。 结论： 1、负载了甲状旁腺相关肽的PLGA微球具有较好的载药率，可以为下一步细胞和分子生物学实验中药物释放终浓度的配制提供依据。 2、负载了甲状旁腺相关肽的PLGA微球在体外可明显促进MC3T3-E1细胞的ALP活性，提示此微球对成骨活性有明显影响。 3、负载甲状旁腺相关肽的PLGA微球可以促进MC3T3-E1细胞基质钙化。 4、负载了甲状旁腺相关肽的PLGA微球促进MC3T3-E1细胞成骨及成血管相关基因的mRNA表达，从分子水平再次证明聚乳酸微球载药缓释系统可显著促进MC3T3-E1细胞体外成骨分化，预示此缓释系统在口腔种植领域具有较好潜在应用前景，为临床解决种植体周围骨量不足等问题提供了新的可能的解决方案。
【关键词】：PTH(1-34) 聚乳酸 控释 分子生物学
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R783.6
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 目录9-10
• 中英文词对照表10-11
• 第1章 引言11-17
• 1.1 重组甲状旁腺素 PTH（1-34）11-14
• 1.2 PTH 间歇给药促进成骨的细胞及分子机制14-15
• 1.3 PTH 的给药方式及 PLGA 在生物医学领域的应用15-17
• 第2章 材料和方法17-24
• 2.1 材料及主要试剂17-18
• 2.2 仪器18
• 2.3 方法18-24
• 第3章 结果24-29
• 3.1 聚合物微球的载药率24
• 3.2 载药聚合物微球对 MC3T3-E1 细胞分化的影响24
• 3.3 载药聚合物微球对 MC3T3-E1 细胞体外矿化能力的影响24-26
• 3.4 载药聚合物微球对 MC3T3-E1 细胞相关基因表达的影响26-29
• 第4章 讨论29-33
• 4.1 体外培养成骨细胞系的选择29-30
• 4.2 PTH 对修复口腔内局部骨缺损的意义30
• 4.3 载药缓释微球对促骨形成调节因子的作用30-33
• 第5章 结论33-34
• 参考文献34-39
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果39-40
• 致谢40-41

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 陆荣;张峰;丁翠翠;李苏亚;;聚乳酸/羟基磷灰石微球的合成与性能[J];化工技术与开发;2010年09期

2 张士博;张U

本文编号：863906