慢病毒介导过表达hTERT人口腔黏膜上皮稳定细胞系的构建

发布时间：2017-09-17 20:56

  本文关键词：慢病毒介导过表达hTERT人口腔黏膜上皮稳定细胞系的构建

  更多相关文章： OMECs hTERT 慢病毒载体 稳定表达 永生化

【摘要】：目的:口腔黏膜疾病是发生于口腔黏膜的所有疾病的总称,其种类繁多,病因复杂且多数疾病的致病机理尚未完全明确。其中起源于口腔黏膜的恶性肿瘤不仅发病率高而且成为影响人们生活质量的常见疾病,甚至严重威胁着生命健康。由于正常的OMECs体外培养困难,对细胞营养要求高而且存活时间短,一般传代培养5~6代后即开始衰老死亡,这严重限制了我们对其发病机制的深入研究,因此,迫切需要一个能够长期稳定传代的OMECs系来作为体外细胞实验模型。本文研究目的:1.使用慢病毒过表达系统构建pLVX-puro-hTERT重组质粒并对其进行包装;2.以包装成功的慢病毒颗粒感染口腔黏膜上皮细胞(OMECs),建立稳定表达外源性人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因的口腔黏膜上皮细胞系,为探索建立高效、稳定的永生化口腔上皮细胞系提供新的思路。方法:1.通过提取293T细胞总RNA,RT-PCR方法扩增获得hTERT基因全长,构建重组慢病毒载体p LVX-puro-hTERT并使用辅助包装系统将其包装为慢病毒颗粒;2.通过使用DisepaeⅡ酶分离,结合Human Epidermal Keratinocyte Complete Medium Kit无血清培养基培养,体外分离培养获取原代OMECs,并用包装好的慢病毒颗粒感染OMECs,通过嘌呤霉素抗性筛选得到阳性克隆,进行传代培养,倒置相差显微镜下观察其生物学性状;3.采用qRT-PCR和Western blot检测培养7代后感染细胞中hTERT基因的mRNA及蛋白表达水平。结果:1.通过RT-PCR获得目的基因片段hTERT,核酸电泳检测可见3kb处有一条亮带,与目的基因大小基本一致。2.重组质粒pLVX-puro-hTERT经NheI和EcoRI双酶切鉴定后,可在3.3kb左右处得到一条亮带,初步表明hTERT已成功插入慢病毒载体pLVX-puro。3.通过对重组质粒进行DNA测序,进一步证实重组慢病毒载体pLVX-puro-hTERT构建成功。4.显微镜下观察可见成功转染hTERT的OMECs与正常OMECs形态相似,细胞呈多边形,“铺路石”状紧密排列,具有典型的上皮细胞特征。而转染空载体后的细胞形态较不规则,未转染细胞和转染空载体后的细胞传4-5代后生长缓慢,逐渐衰老死亡,而转染hTERT后的OMECs仍生长迅速并且增殖稳定。5.qRT-PCR检测转染后OMECs中hTERT的相对表达,结果显示:hTERTmRNA在转染细胞中高表达,与正常OMECs组中hTERTmRNA的表达量呈显著性差异。表明慢病毒介导的hTERT基因片段已稳定整合到OMECs的基因组中并高表达(P0.01)。6.Western blot结果显示在转染细胞组中hTERT蛋白成功表达,与正常细胞组呈显著差异。这说明hTERT基因已成功整合入口腔黏膜上皮细胞的基因组并可进行翻译。结论:本研究通过慢病毒法成功建立了过表达hTERT的OMECs稳定细胞系,初步证明了使用慢病毒载体介导hTERT基因永生化OMECs的可能性及优越性,为探索构建高效、稳定增殖的人永生化口腔粘膜上皮细胞细胞系提供了新思路。
【关键词】：OMECs hTERT 慢病毒载体 稳定表达 永生化
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R781.5
【目录】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 缩略词表9-10
• 第一章 背景研究10-13
• 1.1 口腔黏膜病变的危害10-11
• 1.2 人口腔上皮细胞的体外培养11
• 1.3 永生化的机制11
• 1.4 永生化的方法11-12
• 1.5 本文的研究思路12-13
• 第二章 HTERT-PLVX重组慢病毒载体的构建及慢病毒包装13-27
• 2.1 实验材料和仪器13-15
• 2.1.1 主要试剂和仪器13-14
• 2.1.2 主要溶液及配置14-15
• 2.2 实验方法15-21
• 2.2.1 p LVX-puro-hTERT慢载体的构建15-20
• 2.2.2 hTERT-p LVX慢病毒包装20-21
• 2.3 实验结果21-26
• 2.3.1 hTERT基因的克隆21
• 2.3.2 hTERT重组质粒双酶切鉴定21-22
• 2.3.3 测序结果22-25
• 2.3.4 hTERT-p LVX慢病毒包装25-26
• 2.4 讨论26-27
• 第三章 人口腔上皮细胞的培养与鉴定27-32
• 3.1 实验材料和仪器27-28
• 3.2 实验方法28-29
• 3.2.1 口腔粘膜上皮细胞的分离和原代培养28
• 3.2.2 口腔粘膜上皮细胞的传代培养28
• 3.2.3 口腔粘膜上皮细胞的冻存28-29
• 3.3 实验结果29-30
• 3.3.1 口腔粘膜上皮细胞的分离培养结果29-30
• 3.3.2 口腔粘膜上皮细胞的传代培养30
• 3.4 讨论30-32
• 第四章 过表达HTERT人口腔上皮稳细胞系的筛选及鉴定32-42
• 4.1 实验材料和仪器32-34
• 4.1.1 主要材料和试剂32
• 4.1.2 主要溶液及配置32-34
• 4.2 实验方法34-39
• 4.2.1 过表达hTERT口腔上皮稳定细胞系的筛选34
• 4.2.2 qRT-PCR检测hTERT基因表达34-37
• 4.2.3 Western Blot检测hTERT蛋白表达37-39
• 4.3 实验结果39-41
• 4.3.1 转染后细胞形态及表型39
• 4.3.2 qRT-PCR检测hTERT基因表达结果39-41
• 4.4 讨论41-42
• 第五章 结论与展望42-45
• 5.1 结论42
• 5.2 展望42-45
• 参考文献45-49
• 在学期间主要研究成果49-50
• 致谢50

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 何义舟;hTERT及其基因表达与调控[J];河北医学;2003年08期

2 王俊梅,张波,杨邵敏,韩继生,李冰思,侯琳;PREPARATION AND CHARACTERIZATION OF MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST HUMAN TELOME RASE REVERSE TRANSCRIPTASE[J];Chinese Medical Sciences Journal;2003年03期

3 应磊,戴冰冰,王楚,卢健,钱关祥;EFFECTS OF SP1 SITE TO hTERT PROMOTER ACTIVITY AND ITS RESPONSE TO RETINOID ACID[J];Journal of Shanghai Second Medical University;2005年01期

4 陈凤花;胡丽华;李一荣;王琳;;Expression of Telomerase Subunits in Gastric Cancer[J];华中科技大学学报(医学英德文版);2005年06期

5 李慎秋;熊芬;张春梅;;hTERT在原发性皮肤恶性黑色素瘤中的表达[J];华中科技大学学报(医学版);2006年02期

6 Kawin Leelawat;Surang Leelawat;Thawee Ratanachu-Ek;Somboon Trubwongchareon;Jerasak Wannaprasert;Saad Tripongkaruna;Suchart Chantawibul;Panadda Tepaksorn;;Circulating hTERT mRNA as a tumor marker in cholangiocarcinoma patients[J];World Journal of Gastroenterology;2006年26期

7 丁丽;;人B7.2/hTERT融合基因真核绿色荧光载体的构建[J];郑州铁路职业技术学院学报;2007年02期

8 滕勇;胡蕴玉;王捍国;宿学家;王臻;关玉成;高杰;;hTERT激活人骨髓间充质干细胞端粒酶活性[J];中国矫形外科杂志;2007年16期

9 张险峰;江应安;罗和生;陈维进;;hTERT的转录调节的研究进展[J];国际消化病杂志;2008年05期

10 李一冬;赵国新;曹明瑞;;hTERT重组绿色荧光表达载体的构建与表达[J];中国现代医学杂志;2008年02期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 Shuying Gao;;Construction and identification of a recombinant lentiviral expression vector containing hTERT gene[A];第五届全国生物信息学与系统生物学学术大会论文集[C];2012年

2 李玮;谭建;吴蓓;李宁;;特异性hTERT启动子在肿瘤细胞中的启动效率研究[A];天津市生物医学工程学会第30次学术年会暨生物医学工程前沿科学研讨会论文集[C];2010年

3 于洁;高书颖;;携带hTERT基因的重组慢病毒载体的构建[A];中国的遗传学研究——遗传学进步推动中国西部经济与社会发展——2011年中国遗传学会大会论文摘要汇编[C];2011年

4 ;Simultaneous inhibition of both hTERT and AR gene expression in LNCaP cells using single shRNA vector[A];第十五届全国泌尿外科学术会议论文集[C];2008年

5 赵同伟;卢丽琴;;人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因转录调控研究进展[A];浙江省中西医结合学会肿瘤专业委员会第六次学术年会暨省级继续教育学习班资料汇编[C];2005年

6 黄健;杨敏;金洁;;尿多酸肽对急性髓系白血病细胞端粒酶活性及人端粒酶逆转录酶(hTERT)表达的影响及机制研究[A];2012年浙江省血液病学年会论文集[C];2012年

7 李保顺;陈琼;胡成平;李晓婕;刘胜岗;梁硕;;hTERT siRNA抑制肺癌A549细胞端粒酶活性及诱导细胞凋亡[A];中华医学会第七次全国呼吸病学术会议暨学习班论文汇编[C];2006年

8 ;Tumor therapeutic effect of hTERT targeted lentivirus,monitored by whole-body noninvasive imaging[A];第九次全国消化系统疾病学术会议专题报告论文集[C];2009年

9 张鹏辉;姜习新;涂植光;;hTERT/U6嵌合启动子对肝癌细胞的靶向作用分析[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年

10 ;The Effects of Tankyrase1、hTERT Transfection on Corpus Cavernosum Smooth Muscle Cell[A];中华医学会第八次全国男科学学术会议论文集[C];2007年

中国重要报纸全文数据库 前4条

1 张中桥;检测hTERT表达预测膀胱癌复发[N];中国医药报;2002年

2 王振岭;反义hTERT可促进肺癌细胞凋亡[N];中国医药报;2002年

3 王振岭;反义hTERT可促进肺癌细胞A549凋亡[N];科技日报;2003年

4 吴一福;宫颈癌基因治疗特异性新技术研究成功[N];中国医药报;2006年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 胡长江;FOXO3a/FOXM1在hTERT介导的胃癌细胞侵袭、化疗敏感性中的作用及分子机制研究[D];第三军医大学;2015年

2 宋鸽;GRSF1介导miR-346上调hTERT表达的作用与机制研究[D];天津医科大学;2015年

3 郭红;抗消化系恶性肿瘤hTERT广谱疫苗的分子设计及体内实验初步研究[D];第三军医大学;2006年

4 肖毅;以hTERT为靶点的肿瘤治疗性腺病毒疫苗的研究[D];中国人民解放军医学院;2013年

5 盛建飞;hTERT非端粒酶依赖途径调控喉鳞癌细胞凋亡的研究[D];武汉大学;2012年

6 余松涛;hTERT启动子靶向性活体光学实时成像技术在肿瘤诊断及疗效评估中作用的实验研究[D];第三军医大学;2010年

7 陈陵;hTERT调控相关miRNA的鉴定及功能研究[D];第三军医大学;2011年

8 夏云;靶向人端粒酶逆转录酶（hTERT）RNA干扰的建立及其生物学效应的研究[D];重庆医科大学;2005年

9 王建;靶向hTERT的RNA干扰及其对肿瘤细胞增殖、凋亡影响的机制研究[D];中国医科大学;2008年

10 栾芳;乙肝病毒调控hTERT及ZHX2在肝细胞肝癌发生过程中的作用及机制研究[D];山东大学;2009年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 邬贤;重组腺病毒介导的hTERT C197片段抗肿瘤活性及分子机制研究[D];南方医科大学;2015年

2 李三党;siRNA沉默β-catenin基因对胃癌细胞hTERT影响的研究[D];兰州大学;2015年

3 曹汀明;不同还原态叶酸对人A375及BJ细胞株hTERT和hMLH1转录表达的影响[D];云南师范大学;2015年

4 曾令花;DDRGK1与端粒酶催化亚基hTERT相互作用的研究[D];杭州师范大学;2015年

5 李阳;hTERT调控Gli1的表达对胃癌侵袭迁移的影响及其分子机制研究[D];第三军医大学;2015年

6 侯双双;胆管癌患者胆汁脱落细胞中hTERT、PinX1mRNA的检测及其意义[D];遵义医学院;2016年

7 曾飒;慢病毒介导过表达hTERT人口腔黏膜上皮稳定细胞系的构建[D];兰州大学;2016年

8 梁光萍;hTERT基因转染对人胚胎成纤维细胞生物学行为的影响[D];第三军医大学;2002年

9 丁丽;表达B7.2/hTERT载体的构建和表达[D];郑州大学;2006年

10 苗佩宏;hTERT蛋白表达及其模拟表位筛选[D];第一军医大学;2004年

，

本文编号：871304