细胞因子IGFBP5在脐带间充质干细胞介导牙周组织再生中的作用及机制研究

发布时间：2017-09-26 19:45

  本文关键词：细胞因子IGFBP5在脐带间充质干细胞介导牙周组织再生中的作用及机制研究

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【摘要】：目的:目前间充质干细胞已成为牙周组织再生的种子细胞,然而其定向分化的分子调控机制仍未完全明确,限制了其研究及应用。IGFBP5作为胰岛素样生长因子轴的重要组成,在骨组织发育和再生中有着重要作用,然而其在间充质干细胞及牙周组织再生中的作用尚不清楚。本研究探讨IGFBP5在间充质干细胞成骨分化及牙周组织再生中的作用,进而可作为潜在的细胞因子应用于组织工程化的牙周组织再生。方法:1.间充质干细胞的获取2.构建病毒质粒通过NCBI数据库查询IGFBP5的基因序列,设计IGFBP5基因全长的PCR引物,用PCR的方法得到IGFBP5的全长并加表面标记Flag Tag,将其连接到慢病毒的表达载体上,测序鉴定,最终构建成Flag-IGFBP5的质粒。3.病毒包装及收集慢病毒对照空白质粒、Flag-IGFBP5的质粒及相应的包装质粒(△-F8-74和pMDG)在293T细胞进行转染,48小时后,收集上清,进行病毒滴度鉴定,分装后保存在-80度冰箱。4.稳定转染细胞系的建立对照质粒及Flag-IGFBP5的病毒转染脐带干细胞,转染后一周用流式细胞仪通过筛选标记物GFP得到稳定转染细胞,在mRNA和蛋白水平检测外源性IGFBP5的表达,得到IGFBP5过表达的稳定转染脐带干细胞。5.IGFBP5对干细胞成骨分化性能影响的体外研究用成骨诱导培养液将干细胞在体外向成骨方向分化诱导。通过测定碱性磷酸酶活性来检测早期成骨分化指标碱性磷酸酶,通过ARS染色及测定钙离子浓度来检测晚期成骨指标-细胞矿化能力。并在诱导后3天、7天、10天、2周、3周的不同时间点收获细胞,提取mRNA,在RNA水平检测各个时期成骨分化指标,来研究IGFBP5对间充质干细胞成骨分化的作用。6.脐带间充质干细胞再生小型猪牙周组织的体内研究建立小型猪牙周炎动物模型:采用制造骨缺损、结扎丝线及局部涂布牙周致病菌p.g的方法建立小型猪实验性牙周炎模型,在下颌第一恒磨牙近中邻面形成3mm×5mm×7mm缺损,然后在缺损处放置丝线,局部涂布牙周致病菌p.g。手术后6周可成功形成牙周炎骨缺损模型。7只五指山小型猪建立牙周炎模型,共14侧,随机分为3组:第1组(未治疗对照组):在建模后做翻瓣刮治;第2组(vector组):在建模后做翻瓣刮治+vector转染的脐带干细胞;第3组(flag-igfbp5组):在建模后做翻瓣刮治+过表达igfbp5脐带干细胞。治疗后1个月、3个月通过ct影像学、geomagicstudio12骨计量分析、牙周临床指标检查、elisa和组织病理学结果,观察igfbp5对脐带干细胞介导的小型猪牙周炎缺损组织再生修复能力的影响。7.统计学分析用统计软件spss11.5,采用t检验或者方差分析,p值小于0.05表示有统计学意义。结果:1.构建病毒质粒、病毒包装及收集转染脐带干细胞,通过real-timert-pcr和westernblot方法鉴定igfbp5过表达效果,结果显示igfbp5过表达效果达80%。2.通过测定4d碱性磷酸酶活性、3wars染色、钙离子浓度和诱导后1w、2w、3w不同时间点收取的mrna检测,结果显示与对照组相比,过表达igfbp5的脐带间充质干细胞alp活性、ars染色、钙离子浓度显著增多,成骨/成牙本质的分化指标osx、on、col1a2、opn、dspp、dmp1的表达升高。3.通过geomagicstudio12三维计算新生骨量、ct影像、牙周临床指标检查、elisa及组织病理学结果表明:干细胞治疗12w后,与未治疗对照组和vector组相比,flag-igfbp5组牙龈缘无红肿,位置正常;临床检查指标pd和al恢复正常;有大量牙槽骨和新生牙骨质生成,新形成的牙周膜纤维附着在牙骨质与牙槽骨之间,牙周组织再生良好;龈沟液中炎性因子il8、ifnr、tnfa、il1b的表达量显著低。结论:1.igfbp5可以促进脐带间充质干细胞成骨分化功能。2.igfbp5可以促进脐带间充质干细胞介导的牙周组织再生功能,抑制牙周局部炎症反应。3.IGFBP5可作为候选细胞因子用于组织工程化的牙周组织再生治疗。
【关键词】：IGFBP5 成骨分化 脐带间充质干细胞 牙周组织再生
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R781
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 缩略语/符号说明12-14
• 前言14-16
• 研究现状、成果14-15
• 研究目的、方法15-16
• 一、IGFBP5对脐带间充质干细胞体外成骨分化功能影响的研究16-32
• 1.1 对象和方法17-25
• 1.1.1 实验材料17
• 1.1.2 主要试剂17-18
• 1.1.3 主要设备18
• 1.1.4 间充质干细胞的获取、分离和培养18-19
• 1.1.5 间充质干细胞的冻存和复苏19
• 1.1.6 构建病毒质粒19-23
• 1.1.7 细胞培养基上清中IGFBP5的含量23
• 1.1.8 体外成骨/成牙本质诱导分化23-25
• 1.1.9 统计学分析25
• 1.2 结果25-29
• 1.2.1 在mRNA和蛋白水平，IGFBP5在PDLSCs和BMSCs、WJCMSCs、ADSCs中的表达差异25-26
• 1.2.2 通过real-time RT-PCR和Western Blot鉴定，IGFBP5过表达效果达 80%26
• 1.2.3 IGFBP5过表达后导致WJCMSCs骨向分化潜能显著增强，矿化能力增强26
• 1.2.4 IGFBP5过表达后促进骨粘连蛋白（ON）、Ⅰ型胶原a2链（COL1A2）、骨桥蛋白（OPN）、牙本质涎磷蛋白（DSPP）、牙本质基质酸性磷酸化蛋白（DMP1）、OSX蛋白（OSX）表达上调26-29
• 1.3 讨论29-31
• 1.4 小结31-32
• 二、IGFBP5对脐带间充质干细胞介导的牙周组织再生影响的研究32-45
• 2.1 对象和方法32-36
• 2.1.1 主要实验动物32
• 2.1.2 干细胞制剂的制备32
• 2.1.3 建立小型猪实验性牙周炎骨缺损模型32-33
• 2.1.4 间充质干细胞再生修复小型猪实验性牙周炎骨缺损33
• 2.1.5 治疗后观察指标33-34
• 2.1.6 标本固定，脱钙，脱水处理，，制作石蜡切片34-35
• 2.1.7 石蜡切片HE染色步骤35-36
• 2.1.8 统计学分析36
• 2.2 结果36-42
• 2.2.1 小型猪牙周炎骨缺损模型的建立36
• 2.2.2 IGFBP5促进牙周临床检查指标PD、AL的改善36-37
• 2.2.3 IGFBP5促进脐带间充质干细胞介导的牙周骨组织再生37
• 2.2.4 IGFBP5促进脐带间充质干细胞介导的牙周组织再生37
• 2.2.5 IGFBP5抑制炎性因子IL8、IFNr、TNFa、IL1b的表达37-42
• 2.3 讨论42-44
• 2.4 小结44-45
• 结论45-47
• 参考文献47-53
• 发表论文和参加科研情况说明53-54
• 综述54-62
• 综述参考文献58-62
• 致谢62-63

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