人牙龈成纤维细胞的多分化潜能及骨形成蛋白-2和地塞米松影响其成骨能力的研究

发布时间：2017-10-04 18:12

  本文关键词：人牙龈成纤维细胞的多分化潜能及骨形成蛋白-2和地塞米松影响其成骨能力的研究

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【摘要】：目的:研究人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,h GFs)是否具有成骨、成软骨和成脂的多向分化潜能,同时检测骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)和地塞米松(dexamethasone,DEX)对体外培养的h GFs的细胞增殖活性以及成骨诱导分化的影响。方法:选择就诊于天津医科大学口腔颌面外科的志愿者(18-25岁),经志愿者知情同意后,拔除阻生齿(无龋病、无牙周病),收集术中分离的新鲜健康牙龈组织。采用组织块法提取h GFs,取第3代细胞用于实验。实验分为两部分。第一部分,培养至第3代的人牙龈成纤维细胞,进行多分化包括成骨、成软骨和成脂肪诱导分化研究,分别以DMEM(低糖)与3%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)进行培养作为对照组,分别进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色、茜素红染色、阿利新蓝染色和油红O染色检测成骨、成软骨和成脂分化情况。成骨诱导培养基成分包括DMEM培养基(低糖)、3%FBS、10-2mol/Lβ-甘油磷酸钠、5 mg/L抗坏血酸、2×10-3mol/L L-谷氨酰胺以及10-7mol/L DEX;成软骨诱导培养基成分包括DMEM(低糖)、3%FBS、50 mg/L抗坏血酸、6.25mg/L胰岛素及10μg/L转化生长因子-β1(transforming growth factor,TGF-β1);成脂诱导培养基成分包括DMEM(低糖)、3%FBS、10-6mol/L DEX、10-5mol/L胰岛素、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌(3-Isobutyl-1-methylxanthine,IBMX)及2×10-4mol/L吲哚美辛。第二部分,分5组培养:A组为DMEM培养组,仅使用DMEM培养基(低糖)与3%FBS进行培养;B组为基础骨诱导培养组;C组为基础骨诱导+10-7mol/L DEX培养组;D组为基础骨诱导+50μg/L BMP-2培养组;E组为基础骨诱导培养基+10-7mol/L DEX+50μg/L BMP-2培养组。MTT法检测细胞增殖活性,ALP染色、茜素红染色、逆转录多聚酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测细胞成骨分化情况。结果:(1)培养至7d的ALP染色结果显示成骨诱导组可见大量细胞内染色的蓝紫色沉淀,对照组无沉淀产生;培养至28d,可见成骨诱导组细胞周围有大量红染的钙结节沉积,对照组无红染的钙结节。培养至14d,成软骨诱导组阿利新蓝染色见细胞染色的蓝色沉淀,成脂诱导组细胞内可见油红O染色呈红色的脂肪滴,对照组的h GFs阿利新蓝和油红O染色均成阴性。(2)MTT结果显示:h GFs在所有培养条件下均能够稳定生长,各组细胞在相同时间的增殖活性无明显差异(P0.05)。(3)培养至7d的细胞,碱性磷酸酶染色结果显示:A组无明显蓝紫色沉淀,B组和D组可见少量细胞染色的蓝紫色沉淀,C组和E组可见大量蓝紫色沉淀,E组染色较C组稍深。(4)培养至28d的细胞,茜素红染色结果显示:A组无钙结节形成,其它组均有大量钙结节形成,E组的钙结节量最多,其次为C组,再次是D组、B组。(5)RT-PCR结果显示:同一时间,E组的ALP、胶原蛋白I(collagen 1,Col1)、runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)表达量均为最高(P0.0001);C组的ALP、Col1表达量仅次于E组(P0.0001);而第21d,D组Runx2(P0.05)。7d时,除E组外,各组Runx2表达量均无明显差异;14d时,D组Runx2表达量仅次于E组(P0.05);21d时,C组Runx2表达量仅次于E组(P0.05)。结论:(1)h GFs具有成骨、成软骨和成脂分化的多向分化潜能。(2)BMP-2和DEX对h GFs的细胞增殖无明显影响。(3)单独及联合应用DEX、BMP-2能够促进h GFs的碱性磷酸酶活性和钙结节的形成,两者联合的作用更强,提示两者联合能更有效地促进h GFs成骨分化。
【关键词】：人牙龈成纤维细胞 多分化潜能 骨形态发生蛋白-2 地塞米松 成骨分化
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R781.4
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-11
• 前言11-14
• 研究现状、成果11-12
• 研究目的、方法12-14
• 一、人牙龈成纤维细胞多分化潜能的研究14-22
• 1.1 实验准备14-15
• 1.1.1 主要设备与仪器14-15
• 1.1.2 主要试剂15
• 1.2 对象和方法15-17
• 1.2.1 HGFs的原代培养15-16
• 1.2.2 ALP染色和茜素红染色16
• 1.2.3 阿利新蓝染色16-17
• 1.2.4 油红O染色17
• 1.3 结果17-20
• 1.3.1 HGFs的原代培养17
• 1.3.2 ALP染色和茜素红染色17-19
• 1.3.3 阿利新蓝染色19
• 1.3.4 油红O染色19-20
• 1.4 讨论20-21
• 1.5 小结21-22
• 二、BMP-2 联合DEX对人牙龈成纤维细胞成骨分化的影响22-31
• 2.1 实验准备22-23
• 2.1.1 主要设备与仪器22-23
• 2.1.2 主要试剂23
• 2.2 对象和方法23-26
• 2.2.1 实验分组23-24
• 2.2.2 MTT法细胞增殖检测24
• 2.2.3 ALP染色24
• 2.2.4 茜素红染色24
• 2.2.5 RT-PCR检测成骨相关基因的表达24-26
• 2.2.6 统计分析26
• 2.3 结果26-28
• 2.3.1 MTT法检测细胞增殖活性26-27
• 2.3.2 ALP染色27
• 2.3.3 茜素红染色27-28
• 2.3.4 RT-PCR检测成骨相关基因的表达28
• 2.4 讨论28-30
• 2.5 小结30-31
• 结论31-32
• 参考文献32-36
• 发表论文和参加科研情况说明36-37
• 综述 诱导性多潜能干细胞体外诱导及重编程模式37-46
• 综述参考文献42-46
• 致谢46

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4 唐昊U，

本文编号：972095