变形链球菌耐氟菌株及其亲代菌株ciaH、clpP基因的表达差异分析

发布时间：2017-10-06 19:38

  本文关键词：变形链球菌耐氟菌株及其亲代菌株ciaH、clpP基因的表达差异分析

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【摘要】：目的： 龋病是一种细菌感染性疾病，是一种牙体硬组织的慢性进行性破坏，主要表现为无机物的脱矿及有机物的分解。龋病的特点是发病率高、分布广，，是口腔内最常见疾病。变形链球菌是龋病的主要致病菌[1][2]，其致龋毒力特征主要包括产酸性、耐酸性、粘附性等。一直以来,防治龋病都是一个热点问题，将氟化物用来预防龋病在预防医学领域得到广泛认可。但是，近年来氟化物被高浓度、高频率、长时间的应用于局部导致了耐氟菌株的选择性生长。耐氟菌株的产生为防龋带来了新的课题，G学者等[3]发现当氟化物的环境之下，耐氟菌株比亲代野生株的致龋性强。盛江筠等发现其耐酸性比亲代菌株强，而耐氟菌株耐酸性增强的机制尚未完全清晰，研究已报道了多条变形链球菌的耐酸相关基因，包括ciaH、clpP基因，本课题组前期研究已经发现变形链球菌耐氟菌株的dgk、ffh、comD等基因发生突变[4]，都是通过构建重组质粒、测序的方法来判定基因突变进行定性分析。随着实时荧光定量PCR技术的不断成熟，基因分析的定量化和均相化是未来基因诊断的发展趋势，因此，本实验采用荧光定量PCR技术，选取处于对数生长期、稳定生长期的耐氟菌株及其亲代菌株，对比其表达量，来实现对ciaH、clpP基因表达差异的分析。从基因表达的水平上揭示耐氟菌株及其亲代菌株耐酸机制的改变，解析耐氟菌株耐酸性增强的原因，为研究耐氟菌株的耐酸机制及基因防龋做了铺垫。 方法： 1.变形链球菌的活化、培养，耐氟菌株的体外诱导，两种菌株的表型、生理生化及16SrRNA鉴定。 2.变形链球菌及其耐氟菌株生长曲线的测定。 3.以16sRNA为内参基因，设计ciaH、clpP基因的引物。 4.提取耐氟菌株及其亲代菌株对数生长期、稳定生长期的总RNA,采用实时荧光定量PCR技术测定ciaH、clpP基因的表达量。 结果： 1.成功构建变形链球菌耐氟菌株，表型、生理生化及16SrRNA鉴定其仍为变形链球菌。 2.绘制变形链球菌耐氟菌株及其亲代菌株的生长曲线；确立24h为对数生长期、48h为稳定生长期。 3.成功设计特异性引物。 4.实时荧光定量PCR结果分析显示： （1）变形链球菌耐氟菌株及其亲代菌株ciaH基因在24h、48h时，表达差异均为极显著（P0.01）；且耐氟菌株的表达量远高于亲代菌株;耐氟菌株ciaH基因48h较24h明显增高。 （2）变形链球菌耐氟菌株及其亲代菌株clpP基因24h时，表达差异显著（P0.05）48h时，表达差异极显著（P0.01）；亲代菌株48h的表达量明显高于24h,耐氟菌株48h的表达量明显低于24h;耐氟菌株clpP基因48h较24h明显降低。 结论： ciaH、clpP基因的耐氟菌株及其亲代菌株表达差异显著，这意味着变形链球菌耐氟菌株较亲代菌株功能发生改变，这与耐氟菌株耐酸性增强相关。确定了表达差异的意义，为研究耐氟菌株的耐酸机制及ciaH、clpP基因的具体功能提供了一定的理论基础。
【关键词】：变形链球菌耐氟菌株 亲代菌株 实时荧光定量PCR ciaH基因 clpP基因
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R781.1
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-13
• 第1章 引言13-17
• 1.1 研究现况13-15
• 1.2 研究方法15
• 1.3 研究目的及意义15-17
• 第2章 实验材料17-19
• 2.1 菌株17
• 2.2 试剂盒17
• 2.3 主要仪器17-18
• 2.4 主要试剂18-19
• 第3章 实验方法19-26
• 3.1 变形链球菌的活化、培养19
• 3.2 变形链球菌耐氟菌株的体外诱导19
• 3.3 变形链球菌及其耐氟菌株的表型、生理生化鉴定19-20
• 3.3.1 变形链球菌的表型、生理生化鉴定19-20
• 3.3.2 变形链球菌耐氟菌株的表型、生理生化鉴定20
• 3.4 变形链球菌及其耐氟菌株的 16SrRNA 序列鉴定20-21
• 3.5 变形链球菌及其耐氟菌株的生长曲线的测定21
• 3.6 引物设计21-22
• 3.7 总 RNA 的抽提、纯化和检测22-23
• 3.7.1 总 RNA 抽提的具体步骤如下：22
• 3.7.2 总 RNA 浓度的检测22-23
• 3.8 去除基因组 DNA 反应23
• 3.9 cDNA 的合成23-24
• 3.10 实时荧光定量 PCR24-25
• 3.11 统计学分析25-26
• 第4章 实验结果26-39
• 4.1 变形链球菌及其耐氟菌株的表型、生理生化鉴定26
• 4.2 变形链球菌及其耐氟菌株的 16SrRNA 序列鉴定26-28
• 4.3 变形链球菌及其耐氟菌株的生长曲线28-29
• 4.4 引物设计结果29-30
• 4.5 总 RNA 浓度的检测30
• 4.6 实时荧光定量 PCR 结果30-36
• 4.6.1 16sRNA 扩增曲线30-31
• 4.6.2 ciaH 扩增曲线31-32
• 4.6.3 clpP 扩增曲线32-33
• 4.6.4 16sRNA 溶解曲线33-34
• 4.6.5 ciaH 溶解曲线34-35
• 4.6.6 clpP 溶解曲线35-36
• 4.7 数据分析36-39
• 第5章 讨论39-42
• 第6章 结论42-43
• 参考文献43-48
• 导师简介48-49
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果49-50
• 致谢50

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1 李朋莲;变形链球菌耐氟菌株及其亲代菌株ciaH、clpP基因的表达差异分析[D];吉林大学;2015年

本文编号：984691