“炎症”和健康牙周组织来源干细胞及其细胞膜片的功能：同一患者配对研究

发布时间：2017-10-07 02:00

  本文关键词：“炎症”和健康牙周组织来源干细胞及其细胞膜片的功能：同一患者配对研究

  更多相关文章： 间充质干细胞 牙周膜 炎症 免疫调节 细胞膜片 组织工程

【摘要】：研究背景:近年来研究发现,相对于牙周组织健康牙齿分离而来的干细胞(H-PDLSCs),牙周炎患牙处炎症组织中同样存在干细胞,即“炎症”牙周膜干细胞(I-PDLSCs),且因其来源更加广泛、伦理学问题较少、易于患者接受等优势,具有良好的临床应用潜能,有望应用于将来的组织工程和再生医学中。可惜的是,随着对“炎症”干细胞性能研究的深入,部分学者认为,“炎症”干细胞具有和健康干细胞相似的生物学性能;而另一部分学者则认为,由于体内炎症微环境的影响,“炎症”干细胞的部分生物学性能(特别是成骨分化和免疫调节能力等)明显受损,进而影响其组织再生能力。详细对比分析已有文献发现,造成以上争议的主要原因在于:“炎症”组和健康组样本之间存在明显差异(包括年龄、性别、样本量、纳入排除标准、取材方法等),而这些因素会在一定程度上影响实验结果的准确性。因此,本研究尝试从同一患者来源的“炎症”与健康牙周组织中,同时分离培养I-PDLSCs和H-PDLSCs,在最大限度避免以上影响因素的前提下,通过配对研究的方式,全面对比两种来源PDLSCs的生物学性能,进而明确I-PDLSCs在增殖、分化和免疫调节能力等方面的变化,为将来的深入研究以及组织再生应用提供可靠的依据。研究方法:1、同一患者来源I-PDLSCs和H-PDLSCs分离培养和鉴定:选取同时含有最少1颗牙周炎患牙(无任何保留意义)和最少1颗牙周组织健康牙齿(阻生齿或无功能第三磨牙)的患者作为研究对象,拔牙后,从两种患牙牙根表面,分别刮取“炎症”牙周膜和健康牙周膜,并采用酶消化法分离培养出I-PDLSCs和H-PDLSCs,共得到6组样本。然后,检测两种PDLSCs的细胞标记物表达情况以及细胞增殖、迁移和多向分化能力。2、同一患者来源I-PDLSCs和H-PDLSCs的免疫调节能力分析:从3名无系统性疾病志愿者的新鲜血液中,分别提取外周血单核细胞(PBMNCs)待用。然后,将I-PDLSCs或H-PDLSCs和PBMNCs按照不同比例混合,共培养一定时间后,分析两种PDLSCs对PBMNCs增殖、凋亡和分泌功能的影响。3、同一患者来源I-PDLSCs和H-PDLSCs膜片的功能分析:I-PDLSCs和H-PDLSCs于成膜诱导液中培养10天,待形成细胞膜片后,一方面,体外评估所形成细胞膜片的质量,包括膜片形态构成和多向分化能力检测等;另一方面,选取免疫缺陷小鼠作为动物模型,采用异位移植的方法,将两种PDLSCs膜片分别移植于裸鼠背部皮下组织,8周后取材,进一步分析膜片的体内骨形成潜能。4、统计学分析:本研究中,每组I-PDLSCs和H-PDLSCs的对比实验均设置3个平行组,并求平均值,以减少人为操作可能的误差。然后,对6组实验对象所得到的6个平均值,采用配对t检验的方法(SPSS 18.0软件),进一步统计分析。实验结果中所有计量资料均采用均数±标准差(X±SD)的形式表示。检验水准P值取0.05,即当P0.05时,I-PDLSCs和H-PDLSCs之间存在统计学差异。.实验结果:1、本研究中,每名患者口内均可以同时分离培养出I-PDLSCs和H-PDLSCs,且都阳性表达波形蛋白(间充质细胞特异性中间丝蛋白)和间充质干细胞表面标记物(STRO-1、CD146、CD105和CD44),而阴性表达上皮角蛋白(上皮细胞特异性中间丝蛋白)和造血细胞表面标记物(CD45和CD34)。另外,细胞生物学性能对比结果显示:尽管两种PDLSCs的成脂分化能力无明显差别,但是相对于H-PDLSCs,I-PDLSCs的增殖和迁移能力明显增强,而成骨分化能力明显受损。2、I-PDLSCs或H-PDLSCs和PBMNCs按照不同比例共培养一定时间后,PBMNCs增殖结果显示,I-PDLSCs和H-PDLSCs均对PBMNCs的增殖率存在影响,且在72小时时,I-PDLSCs组中PBMNCs的增殖率会明显高于H-PDLSCs组(P0.05或0.01)。同时,在72小时时,PBMNCs凋亡检测显示,I-PDLSCs促进PBMNCs凋亡的能力亦是明显减弱。另外,在72小时时,细胞培养上清液中细胞因子含量分析结果表明,尽管两组共培养体系中IL-10的表达并无统计学差异,但是I-PDLSCs组中IL-2、IFN-γ和TNF-α的含量均明显高于H-PDLSCs组(P0.05或P0.01)。3、I-PDLSCs和H-PDLSCs成膜诱导10天后,均可以形成典型的细胞膜片结构。膜片形态构成分析结果显示,相比于H-PDLSCs膜片,I-PDLSCs膜片的厚度和活细胞数明显减少(P0.05或0.01),而I-PDLSCs膜片中I型胶原蛋白、骨膜蛋白和整合素β1的表达水平则较高(相对于膜片中的总蛋白而言)。膜片功能评估,一方面,体外多向分化能力检测显示,和细胞水平对比结果相似,I-PDLSCs膜片的成骨和成软骨分化能力明显减弱。另一方面,膜片体内移植后HE染色,进一步证实,I-PDLSCs膜片移植物中新骨区域占总面积的比例,明显低于H-PDLSCs膜片组(P0.05)。结论1、细胞水平、免疫调节水平和细胞膜片水平对比分析结果表明,尽管I-PDLSCs的体外多向分化能力、免疫调节能力以及体内骨再生能力均明显降低,但是其仍然具有一定的间充质干细胞性能,体外/体内实验可以形成典型的矿化结节/骨组织,可能成为一种潜在的间充质干细胞来源,应用于牙周组织再生治疗。另外,I-PDLSCs的性能特点,例如明显增强的增殖和迁移能力,同样值得进一步研究。2、同一患者来源I-PDLSCs和H-PDLSCs对比分析,为进一步探索I-PDLSCs的性能特点和临床应用策略,提供了一种值得借鉴的研究方法。
【关键词】：间充质干细胞 牙周膜 炎症 免疫调节 细胞膜片 组织工程
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R781.4
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-16
• 文献回顾16-25
• 牙周膜干细胞的研究进展16-20
• 1 牙周膜干细胞的性能及其影响因素17-18
• 2 牙周膜干细胞在牙周组织再生中的应用18-19
• 3 “炎症”牙周膜干细胞的发现和研究进展19-20
• 细胞膜片技术的研究进展20-25
• 1 细胞膜片技术的优势20-21
• 2 细胞膜片的制作方法21
• 3. 细胞膜片质量评估21-23
• 4 细胞膜片技术在牙周再生中的应用23-25
• 实验一 同一患者来源I-PDLSCs和H-PDLSCs的分离培养和鉴定25-46
• 1 材料26-28
• 2 方法28-36
• 3 结果36-43
• 4 讨论43-46
• 实验二 同一患者来源I-PDLSCs和H-PDLSCs的免疫调节能力分析46-53
• 1 材料46-47
• 2 方法47-49
• 3 结果49-51
• 4 讨论51-53
• 实验三 同一患者来源I-PDLSCs和H-PDLSCs膜片的功能分析53-66
• 1 材料53-54
• 2 方法54-57
• 3 结果57-64
• 4 讨论64-66
• 小结66-68
• 参考文献68-76
• 个人简历和研究成果76-77
• 致谢77

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