复合基因纳米纤维支架促进骨再生的研究

发布时间：2017-10-08 14:36

  本文关键词：复合基因纳米纤维支架促进骨再生的研究

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【摘要】：近年来，随着组织工程的发展需要，各种满足不同要求的生物医用支架材料得到了广泛研究。利用生物医用材料治疗骨组织缺损成为骨组织修复的一个新选择。 通过静电纺丝法制备的纳米纤维支架直径为纳米级，比表面积大，因而具有独特的小尺寸效应和表面效应。另外由于结构类似于天然细胞外基质，有利于细胞黏附，进而促进细胞增殖及分化[1]，使该方法成为制备组织工程支架材料的最佳选择之一。但是，现阶段研究显示：体内局部细胞不足，单纯的纳米纤维支架促进骨形成的能力有限[14]。因此，需要生长因子或细胞与纳米纤维支架复合发挥骨诱导作用，外源细胞引入具有引起机体适应性免疫反应及细胞不能成活等缺点。 骨形成蛋白2（Bone morphogenetic protein-2,BMP2）是公认的促进骨再生的生长因子。促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）可促进内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells, EPCs)迁移、促进培养的人间充质干细胞趋化，促进局部血管的形成，，为骨再生提供良好的微环境[2,3]。然而，蛋白类生长因子部分造价较高以及具有免疫原性，较难得到广泛应用。因此，可以应用负载生长因子基因的载体，通过转染自体细胞原位表达相应生长因子以达到治疗目标。但是，单纯在骨缺损处应用病毒不仅会使病毒随体液扩散，降低病毒浓度，还有可能造成异位感染[4]。目前的解决方法是利用生物材料将病毒固定于应用部位。例如[5]：将病毒混入静电纺丝溶液中，通过高压静电纺丝装置将病毒与纳米纤维共纺。其缺点在于高压及有机溶剂会降低病毒活力且病毒不易定量。这为腺病毒在体内应用促进骨缺损修复造成了困难。因此，我们通过制备聚乳酸-羟基乙酸纳米纤维支架，利用蔗糖作为冷冻保护剂，采用冷冻干燥法将聚乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA）与腺病毒复合。通过扫描电子显微镜观察PLGA纳米纤维支架的表面形貌，通过DNA定量试剂盒检测腺病毒在PLGA纳米纤维支架上的释放动力学；通过编码绿色荧光蛋白（EGFP）基因的腺病毒Ad-EGFP感染骨髓基质细胞（Bone marrow stroma cell, BMSCs）使细胞表达EGFP在体外检测PLGA/腺病毒复合纳米纤维支架上病毒的活力。通过Real-time PCR和茜素红染色检测编码BMP2基因的腺病毒Ad-BMP2对大鼠BMSCs成骨向分化及钙结节形成的影响。另外，我们将载EPO基因和BMP2基因的纳米纤维支架植入大鼠颅骨缺损动物模型，通过Micro-CT和组织学分析检测其体内成骨能力。通过上述实验的一些初步成果显示，通过静电纺丝方法制备的PLGA纳米纤维支架纤维交错，纤维表面平滑，孔隙率较高；腺病毒在PLGA表面释放为突释曲线；此外，冷冻干燥法能够局部提高病毒浓度，在体外能够促进Ad-EGFP感染BMMSCs表达EGFP，Ad-BMP2能够明显增强BMSCs向成骨细胞分化，并促进其钙结节形成。在体内能够在颅骨缺损局部原位表达EPO及BMP2，增加血管形成，为骨再生提供一个良好的微环境。 综上，PLGA/Ad纳米纤维支架能够良好的保留腺病毒活性，具有良好的促进体内外新骨组织形成的能力，因此，它作为一种新形式的病毒材料复合物可能为骨组织工程领域中生物医用材料的应用提供一个新的选择。
【关键词】：BMP2 EPO 骨再生 纳米纤维 腺病毒
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R783.1
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 引言11-12
• 第1章 文献综述12-15
• 1.1 骨组织工程12-14
• 1.1.1 纳米纤维支架12
• 1.1.2 种子细胞12-13
• 1.1.3 生长因子13-14
• 1.2 载病毒的纳米材料在骨组织工程中的应用14-15
• 第2章 纳米支架材料的合成和表征15-20
• 2.1 实验材料和仪器15
• 2.2 实验方法15-17
• 2.2.1 纳米纤维支架的制备和形貌观察15-16
• 2.2.2 腺病毒/蔗糖溶液的制备16
• 2.2.3 PLGA 与腺病毒的复合16
• 2.2.4 载基因支架材料体外控释实验16-17
• 2.3 实验结果17-18
• 2.3.1 纳米纤维支架的扫描电镜结果17
• 2.3.2 体外病毒释放结果17-18
• 2.4 讨论18-20
• 第3章 纳米纤维支架复合腺病毒对腺病毒活性的影响20-23
• 3.1 实验材料和仪器20
• 3.2 实验方法20-21
• 3.2.1 骨髓基质细胞的提取与培养20-21
• 3.2.3 PLGA/Ad-EGFP 对骨髓间充质干细胞的感染活性21
• 3.3 实验结果21-22
• 3.3.1 PLGA/Ad-EGFP 对骨髓间充质干细胞的感染情况21-22
• 3.4 讨论22-23
• 第4章 载 BMP2 的纳米纤维支架在体内外促进骨组织再生的实验研究23-32
• 4.1 实验试剂和仪器23
• 4.2 实验方法23-28
• 4.2.1 ELISA 检测 Ad-BMP2 感染 BMSCs 后 BMP2 的分泌情况23-24
• 4.2.2 Ad-BMP2 对骨髓间充质干细胞的成骨向分化的影响24-26
• 4.2.3 茜素红染色26-27
• 4.2.4 建立大鼠颅骨缺损动物模型27
• 4.2.5 新生骨量检测27
• 4.2.6 组织学分析27
• 4.2.7 统计学分析27-28
• 4.3 实验结果28-30
• 4.3.1 Ad-BMP2 对骨髓间充质干细胞成骨向分化的影响28
• 4.3.2 Ad-BMP2 对骨髓间充质干细胞成骨向分化的影响28-29
• 4.3.3 茜素红染色检测 Ad-BMP2 感染 BMSCs 后细胞的矿化能力29
• 4.3.4 MicroCT 检测大鼠颅骨缺损部位的修复情况29-30
• 4.3.5 HE 染色检测大鼠颅骨缺损部位的修复情况30
• 4.4 讨论30-32
• 第5章 载 EPO 的纳米纤维支架促进骨组织再生的体内研究32-35
• 5.1 实验试剂和仪器32
• 5.2 实验方法32
• 5.3 实验结果32-34
• 5.3.1 MicroCT 检测大鼠颅骨缺损部位的修复情况32
• 5.3.2 HE 染色检测大鼠颅骨缺损部位的修复情况32-34
• 5.4 讨论34-35
• 第6章 结论35-36
• 参考文献36-40
• 在学期间所取得的科研成果40-41
• 后记和致谢41

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本文编号：994579