水痘—带状疱疹病毒临床分离株基因型别分析与流行病学调查

发布时间：2017-04-12 14:13

  本文关键词：水痘—带状疱疹病毒临床分离株基因型别分析与流行病学调查，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】： 目的:首先,利用限制性片段长度多态性分析(RFLP)、聚合酶链反应(PCR)和DNA测序方法,对从水痘或带状疱疹病人皮肤疱疹液中分离、鉴定后获得的水痘-带状疱疹病毒(VZV)临床分离株的基因型进行分析,研究该病毒的分子流行病学特征,明确合肥地区VZV临床分离株的主要基因型及其与国外各地区基因型的区别,并进一步分析感染是由疫苗株(v-Oka)还是野毒株引起的,同时了解可能的疫苗反应和疫苗株在水痘敏感人群的传播状况及病毒的进化状态。 其次,应用膜抗原荧光抗体试验(FAMA)对从临床收集的血清标本进行分析,研究VZV的血清流行病学特点,根据正常人群中VZV的流行现状,为水痘预防措施的制定提供依据。 方法:从临床采集水痘或带状疱疹患者皮肤水疱液共36份,将其接种至人胚胎成纤维细胞(HF),进行病毒分离;对分离得到的病毒株应用间接免疫荧光法鉴定后,扩增病毒并提取VZV临床分离株与v-Oka株的基因组DNA。经过PCR扩增VZV开放读码框(ORF)1、21、22、38、54、62和R5可变区的部分片段,通过RFLP对ORF38、54和62的PstI、BglI和SmaI酶切位点的突变情况进行分析,通过比较PCR产物长度分析R5可变区重复单位的拷贝数,同时对ORF1、21、22和54的PCR产物进行测序,分析其中一些特定SNP位点的突变情况,从而确定其基因型别。 从医院检验科保存的3557份体检者血清中随机抽取592份血清,采用以VZV感染细胞作为抗原、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗人IgG作为二抗的FAMA试验检测血清中特异性VZV抗体,进行VZV的流行病学调查。 结果:从临床采集的36份标本中分离鉴定后得到19例VZV临床分离株,病毒分离阳性率为52.8%。RFLP分析结果显示,19例临床分离株的酶切位点特征均为PstI+ BglI+ SmaI-,而v-Oka株为PstI- BglI+ SmaI+;R5可变区PCR结果出现359bp(R5A)和471bp(R5B)两种结果, R5A有9例(47.4%),R5B有10例(52.6%);对ORF1, 21, 22, 54的PCR产物进行测序分析发现19例临床分离株均归属为基因型J1,不同于v-Oka株所归属的基因型J2,进一步分析还发现19例临床分离株中有4例(21%)在ORF1中核苷酸780～781位点之间插入了3个核苷酸CGG,它们编码一个脯氨酸;另外,在其中的2株临床分离株中还发现了3个不同的突变位点分别为ORF21 (SNP 33608) CT、ORF54 (SNP 95150) TG、ORF22 (SNP 38055) CA。 血清学实验表明用FAMA试验检测VZV抗体,与其他的疱疹类病毒的相应抗体不产生交叉反应,具有高度特异性。应用此法检测592份血清标本中,VZV抗体总体阳性率为76.52%;1~3岁、4~6岁、7~13岁、14~19岁、20~29岁、30~39岁、40~49岁及50岁各年龄组的血清抗体阳性率分别是14.67%,51.56%,73.91%,91.26%,92.78%,95.65%,98.11%和100%。1~3岁年龄组血清抗体阳性率最低,血清抗体阳性率随年龄的增大而升高。不同性别间阳性率差异无统计学意义(P0.005),不同年龄组间阳性率差异有统计学意义(P0.001)。 结论:水痘或带状疱疹患者皮肤水疱液中VZV病毒颗粒含量较多,标本接种在人胚成纤维细胞上3~7d可产生明显的细胞病变效应(CPE),病毒分离阳性率为52.8%。RFLP分析结果显示19例临床分离株均为PstI+ BglI+ SmaI-,国外已有研究表明具有这种酶切特征的毒株多出现在欧洲和北美,亚洲较为少见,该酶切特征与v-Oka株的酶切特征PstI- BglI+SmaI+不同,说明本实验中所分离到的VZV临床分离株并不是v-Oka株。DNA测序分析结果显示所有19例毒株均属于J1型,与欧洲、美国、日本的VZV毒株基因型不相同,与v-Oka株的基因型(J2型)也不同,说明本实验中获得的VZV临床分离株并不是v-Oka株,疾病不是由v-Oka株引起的。 血清学研究表明,FAMA法检测人群中VZV抗体与其他的疱疹类病毒的相应抗体不产生交叉反应,是VZV抗体检测的可靠方法。VZV感染主要发生在儿童时期,因此预防水痘感染和流行,应以1～3岁儿童为VZV疫苗免疫的首选对象,3岁以上者宜选择没有水痘史的儿童作为免疫对象。
【关键词】：水痘-带状疱疹病毒 基因分型 v-Oka株 临床分离株 膜抗原荧光抗体试验 血清抗体阳性率
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R752.12;R181.3
【目录】：

• 缩略词表6-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-12
• 第一部分 水痘-带状疱疹病毒临床分离株基因型别分析及其与 Oka 疫苗株的区别12-35
• 1.1 引言12-18
• 1.1.1 VZV 的生物学特性及所致疾病12-13
• 1.1.2 VZV 的基因组结构13
• 1.1.3 VZV 基因组变异13-15
• 1.1.4 VZV 基因分型15-17
• 1.1.5 VZV 感染的预防17-18
• 1.2 材料和方法18-23
• 1.2.1 实验方案18-19
• 1.2.2 材料与试剂19-21
• 1.2.3 方法21-23
• 1.3 结果23-29
• 1.3.1 病毒分离结果23-24
• 1.3.2 病毒鉴定结果24
• 1.3.3 ORF38 的限制性片段长度多态性分析结果24-25
• 1.3.4 ORF54 的限制性片段长度多态性分析结果25-26
• 1.3.5 ORF62 的限制性片段长度多态性分析26-27
• 1.3.6 R5 可变区分析27
• 1.3.7 序列分析结果27-29
• 1.4 讨论29-33
• 1.4.1 VZV 病毒分离29-30
• 1.4.2 VZV 临床分离株基因型别分析30-31
• 1.4.3 VZV 临床分离株与Oka 疫苗株的区别31-33
• 1.4.4 VZV 基因分型与 Oka 疫苗株区别的意义33
• 1.4.5 本研究不足之处及下一步研究目标33
• 1.5 结论33-35
• 第二部分 应用膜抗原荧光抗体试验对 VZV 进行血清流行病学调查35-45
• 2.1 引言35-36
• 2.2 材料和方法36-38
• 2.2.1 实验方案36
• 2.2.2 材料与试剂36-37
• 2.2.3 方法37-38
• 2.3 结果38-40
• 2.3.1 FAMA 试验结果观察与判定38-39
• 2.3.2 不同年龄组人群血清中 VZV 抗体阳性率39-40
• 2.4 讨论40-44
• 2.5 结论44-45
• 参考文献45-53
• 附录一：简历53-54
• 附录二：致谢54-55
• 附录三：综述55-66

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