淡色库蚊溴氰菊酯抗性基因XN-P450的克

发布时间：2017-05-13 11:13

  本文关键词：淡色库蚊溴氰菊酯抗性基因XN-P450的克隆、分析及CYP6F1的表达，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：淡色库蚊是一种分布极广的全球性卫生害虫，能够传播多种致命疾病。对其的防治主要是使用各类化学杀虫剂，这引起了杀虫剂抗性的产生和发展。淡色库蚊抗性机理及抗性基因的研究成为热点。本论文以淡色库蚊为材料进行了以下三方面的实验： 1.比较使用了五种改良的方法：异硫氰酸胍法、Trizol法、Trizol+CTAB法、改良的Trizol法和CTAB法，从淡色库蚊抗性品系中提取总RNA，通过对所提总RNA的纯度、浓度、完整性以及耗用时间等方面进行比较，并以实时荧光定量PCR的方法来定量比较了五种方法所提取产物中RNA的拷贝数，结果显示：改良的CTAB法为淡色库蚊总RNA提取的最优法。 2.以淡色库蚊抗性相关的EST（EC093830.1）序列为模板，设计基因特异性引物，通过RACE的方法克隆得到了长为1637bp的cDNA全长序列——XN-P450。确定其开放阅读框长1521bp，通过软件对其进行氨基酸、跨膜区、亚细胞定位、二级结构及酶切位点等的预测。结果表明XN-P450编码蛋白质有506个氨基酸，二级结构有53.16%的α螺旋，14.62%的β折叠及32.21%的环，含4个主要的跨膜螺旋；经亚细胞定位发现该蛋白多定位于线粒体和细胞质，且多在分泌通道部位，有多种酶类的切割位点，这些都指明了该蛋白是一类能够参与代谢、分泌等多种反应的膜蛋白，推测其参与了淡色库蚊的代谢抗性；通过定量PCR发现XN-P450在淡色库蚊抗性中的表达量是敏感品系的1.58倍，这进一步证实其在淡色库蚊的抗药性中扮演着代谢抗性执行者的角色。 3. CYP6FI是淡色库蚊抗性基因中研究比较透彻且比较典型的一例，该基因有着抗性代谢解毒酶基因最大一类的细胞色素P450的一些保守特征。本研究合成特异性引物，并以淡色库蚊不同发育时期的幼虫、蛹及成虫所提RNA反转录得到的cDNA为模板，进行定量PCR鉴定。结果发现CYP6FI对于β-actin的相对表达量在淡色库蚊体内随着发育时期的延长在不断增加，即相对于比较敏感的幼虫，，具有抗性的成虫中该基因是超表达的。 综上所述，以筛选得到的最合适淡色库蚊RNA提取的方法为基础，克隆得到抗性基因XN-P450，分析其结构及所编码的蛋白质序列，预测其功能，并检测其在抗性与敏感品系中的表达差异，以确定该基因与抗性的相关性；定量检测CYP6FI在不同发育时期的表达量的变化趋势。通过以上三部分研究为淡色库蚊总RNA提取找到一条最优途径，并且丰富了抗性基因的内容，为新型杀虫剂的研发和使用提供了理论指导，共同为蚊虫的有效防治提供理论基础。
【关键词】：淡色库蚊 抗性基因 CYP6F1 表达 生物信息学分析
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R184
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 第一章 文献综述11-24
• 1.1 蚊虫防治和杀虫剂抗性11-13
• 1.2 昆虫的抗药性机理13-17
• 1.2.1 代谢抗性13-15
• 1.2.1.1 细胞色素 P450 单加氧酶14
• 1.2.1.2 非专一性酯酶14-15
• 1.2.1.3 谷胱甘肽-S-转移酶15
• 1.2.2 靶标抗性15-16
• 1.2.2.1 乙酰胆碱酯酶15
• 1.2.2.2 钠离子通道15-16
• 1.2.2.3 γ-氨基丁酸受体氯离子通道16
• 1.2.3 抗药性的遗传研究16-17
• 1.3 抗性基因研究技术17-18
• 1.4 淡色库蚊杀虫剂抗性相关基因研究现状18-22
• 1.4.1 我国近年对淡色库蚊抗性的监测18-19
• 1.4.2 淡色库蚊抗性基因研究状况19-22
• 1.4.2.1 细胞色素 P450 家族的研究19-20
• 1.4.2.3 钠离子通道基因的研究20
• 1.4.2.4 丝氨酸蛋白酶基因家族的研究20-21
• 1.4.2.5 视蛋白基因的研究21
• 1.4.2.6 跨膜蛋白基因的研究21-22
• 1.4.2.7 蚊核糖体蛋白基因的研究22
• 1.5 研究内容和意义22-24
• 第二章 不同方法提取淡色库蚊总 RNA 的定量比较分析24-34
• 2.1 材料与方法24-28
• 2.1.1 总 RNA 的提取25-26
• 2.1.2 总 RNA 核酸浓度检测与电泳检测26
• 2.1.3 总 RNA 的纯化26-27
• 2.1.4 反转录及其产物检测27
• 2.1.5 实时荧光定量 PCR（基于标准曲线的绝对定量）27-28
• 2.2 结果与分析28-31
• 2.2.1 五种方法获得总 RNA 的纯度、产量及电泳检测28-29
• 2.2.2 总 RNA 经 DnaseI 纯化的结果29-30
• 2.2.3 五种方法方法耗时比较30
• 2.2.4 反转录及其 PCR 产物电泳结果分析30-31
• 2.2.5 五种方法所提总 RNA 定量分析31
• 2.3 讨论31-34
• 第三章 淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关基因 XN-P450 cDNA 的克隆与生物信息学分析34-45
• 3.1 材料与方法34-37
• 3.1.1 淡色库蚊抗性与敏感品系蚊虫的总 RNA 的提取34
• 3.1.2 cDNA 第一链的合成34-35
• 3.1.2.1 3’-RACE-Ready- cDNA 的合成34-35
• 3.1.2.2 5’-RACE-Ready-cDNA 的合成35
• 3.1.3 EST 的引物验证及结果测序35
• 3.1.4 淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关基因的 3’、5’-RACE 扩增、检测35-36
• 3.1.4.1 3’-RACE PCR35-36
• 3.1.4.2 5’-RACE PCR36
• 3.1.5 基因测序36
• 3.1.5.1 RACE 产物的纯化36
• 3.1.5.2 克隆36
• 3.1.5.3 阳性克隆检测36
• 3.1.5.4 测序结果的比对分析36
• 3.1.6 全长 cDNA 的扩增36
• 3.1.7 生物信息学分析36-37
• 3.1.8 定量分析37
• 3.2 实验结果与分析37-43
• 3.2.1 抗性与敏感品系库蚊的总 RNA 提取37-38
• 3.2.2 cDNA 第一链的合成38
• 3.2.3 EST 引物验证38
• 3.2.4 3’、5’- RACE 扩增及测序38
• 3.2.5 全长 cDNA 的扩增38-40
• 3.2.6 全长基因的生物信息学分析40-43
• 3.2.7 定量分析该基因在两种品系蚊虫中的差异表达43
• 3.3 讨论43-45
• 第四章 淡色库蚊抗性基因 CYP6F1 的时序性表达45-50
• 4.1 材料与方法45-46
• 4.1.1 不同发育时期淡色库蚊总 RNA 的提取45-46
• 4.1.2 总 RNA 的纯化、反转录46
• 4.1.3 实时荧光定量 PCR（相对定量）46
• 4.2 结果及分析46-48
• 4.2.1 不同发育时期库蚊总 RNA 提取的浓度和纯度46
• 4.2.2 总 RNA 的纯化及反转录46-47
• 4.2.3 定量结果47-48
• 4.3 讨论48-50
• 第五章 结论50-51
• 参考文献51-57
• 致谢57-58
• 作者简介58

【参考文献】

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本文编号：362430