分离自商陆的根际真菌SL-30杀灭钉螺作用研究

发布时间：2017-08-20 18:24

  本文关键词：分离自商陆的根际真菌SL-30杀灭钉螺作用研究

  更多相关文章： 商陆 根际 微生物 杀螺活性 钉螺 机理 定殖

【摘要】：钉螺是日本血吸虫的唯一中间宿主,因此杀灭钉螺是预防和控制血吸虫病流行的重要措施之一。目前使用的灭螺药物不同程度地存在成本高昂、选择性较弱、持久性差、易造成环境污染等不足,限制了其广泛应用。本研究从植物根际环境筛选杀螺活性微生物,旨在寻找高效安全的微生物来源杀螺活性成分,并探索杀螺活性微生物可行的原位应用方式,以补充化学灭螺药物的不足。主要结果如下： 1、对14种具有杀螺活性的药用植物的根际土进行微生物分离,最终从商陆根际分离筛选到一株具有显著杀螺活性的真菌菌株SL-30,其4%发酵液24 h杀螺率达100%,且该浓度下对鱼虾等非靶生物无明显毒性,且发酵液具有一定的热稳定性和光照稳定性。结合菌落特征、分生孢子头形态以及rDNA-ITS序列分析,初步将菌株SL-30鉴定为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。 2、以杀螺活性为检测指标,通过单因素试验和Plackett-Burman试验确定可溶性淀粉用量、蛋白胨用量和初始pH是发酵液杀螺活性的主要影响因子,结合响应面分析法,得到菌株SL-30的优化发酵条件为：可溶性淀粉16.40 g/L,蛋白胨3.76g/L,磷酸二氢钾0.5 g/L,硫酸镁0.25 g/L,接种量0.5%,装液量50 ml/250 ml,初始pH 3,培养温度28℃。经6批次发酵,结果证实该优化条件准确可靠。 3、菌株SL-30发酵液经系统分离和杀螺活性检测筛选到乙醚极性部位,经硅胶柱层析纯化得到具有高效杀螺活性的主要成分MI,其杀灭钉螺的24 h LC50值为0.101 mg/L,48 h LC50值为0.062 mg/L,72 h LC50值为0.022 mg/L,24 h LC90值为0.355 mg/L,48 h LC90值为0.121 mg/L,72 h LC90值为0.066 mg/L。经HPLC.IFR.LC/MS/MS.1H-NMR.13C-NMR.1H-1H COSY和1H-13C HSQC等研究方法分析确定MI为胶霉毒素(gliotoxin).且杀螺活性成分MI在有效杀螺浓度下不引起鱼和蛙类(蝌蚪)等非靶水生生物的死亡,对蚯蚓和土壤微生物等非靶陆地生物均为低毒。 4、经过钉螺组织细胞Hoechst 33342染色核形分析,显示诱导细胞凋亡不是MI致钉螺中毒和死亡的主要途径。 5、经光学显微镜和透射电镜观察,结果显示MI可引起钉螺组织形态和细胞超微结构改变,正常的组织形态和细胞结构是维持机体正常生命活动的结构基础,其发生改变可导致组织和细胞功能异常、代谢功能障碍等,与钉螺的中毒和死亡有 一定关联。 6、经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,显示MI影响钉螺肝脏酯酶同工酶的活性和组成,干扰钉螺的解毒功能,当MI浓度超过其解毒能力时,可导致钉螺中毒和死亡 7、经酶活性测定,结果显示MI显著增加钉螺MDH、Na+K+-ATPase和Mg2+-ATPase的活性；显著降低CHE活性；对AKP和GPT活性的影响为先升高后降低；SDH活性先降低后升高；LDH为头足部酶活性增强,肝脏部位酶活性降低。可见,MI对钉螺机体造成很大损伤,影响钉螺体内神经介质传递,致神经之间的信息传递功能异常；对无氧呼吸、有氧呼吸位点均有作用,引起糖代谢加快使得体内贮存消耗加速,ATP的过度利用加速能量耗竭,能量代谢的异常和各项生理功能紊乱和丧失,是引起钉螺死亡的重要原因之一。 8、通过急性毒性测试,显示菌株SL-30的分生孢子对水体、斑马鱼和河虾安全,对小鼠经口、大鼠经皮和大鼠吸入急性毒性属于低毒级,初步得出其具有较好的生物安全性。经根周土浸提液杀螺活性检测,菌株SL-30接种至未灭菌的非根际土壤后第20 d开始呈现杀螺活性,第40 d杀螺活性基本消失；而抗性突变株Nysr-2接种至根周,至第90 d仍可检测到一定程度的杀螺活性,且接种后60 d内可较稳定地定殖于根周。可见,菌株SL-30在土壤环境可发挥一定的杀螺活性,且在根际环境杀螺活性维持的时间更长。
【关键词】：商陆 根际 微生物 杀螺活性 钉螺 机理 定殖
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R184
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 缩略语表11-18
• 第一章 绪论18-36
• 1.1 血吸虫病及其病原体18-21
• 1.1.1 血吸虫病18-19
• 1.1.2 日本血吸虫19
• 1.1.3 血吸虫病的治疗19-20
• 1.1.4 血吸虫病的控制20-21
• 1.2 杀灭钉螺-控制血吸虫病的重要措施21-28
• 1.2.1 钉螺的生物学分类地位与分布21
• 1.2.2 钉螺的形态与结构21-22
• 1.2.3 杀灭钉螺的措施22-27
• 1.2.4 药物灭螺的机理27-28
• 1.3 杀虫类微生物农药28-31
• 1.3.1 杀虫类微生物农药种类29-30
• 1.3.2 微生物农药的安全性评价30-31
• 1.4 根际微生物31-33
• 1.4.1 根际与根际微生物31
• 1.4.2 具有抑菌杀虫效果的根际微生物31-32
• 1.4.3 目的菌株的应用方式32-33
• 1.5 本论文的立题依据和主要研究内容33-36
• 第二章 根际杀螺活性微生物的筛选36-56
• 2.1 材料36-38
• 2.1.1 生物材料36
• 2.1.2 培养基36-37
• 2.1.3 主要试剂37
• 2.1.4 主要仪器37-38
• 2.2 方法38-43
• 2.2.1 根际土的采集38-39
• 2.2.2 菌株的分离纯化39
• 2.2.3 杀螺活性菌株的筛选39-40
• 2.2.4 杀螺活性菌株发酵液对鱼虾的急性毒性测定方法40
• 2.2.5 多糖和蛋白成分的影响40
• 2.2.6 发酵液稳定性检测40-41
• 2.2.7 发酵液对钉螺软体组织重量、糖原和总蛋白含量的影响41
• 2.2.8 菌株SL-30的鉴定方法41-43
• 2.3 结果与分析43-55
• 2.3.1 杀螺活性菌株筛选结果43-45
• 2.3.2 菌株SL-30和YT-16发酵液杀螺活性比较45-46
• 2.3.3 菌株SL-30和YT-16发酵液对鱼虾的急性毒性46-48
• 2.3.4 菌株SL-30发酵液LC_(50)值和LC_(90)值的测定结果48-49
• 2.3.5 菌株SL-30发酵液的稳定性49-51
• 2.3.6 菌株SL-30发酵液对钉螺软体组织影响51-52
• 2.3.7 菌株SL-30的鉴定结果52-55
• 2.4 本章小结与讨论55-56
• 第三章 菌株SL-30发酵条件的优化56-72
• 3.1 材料56
• 3.1.1 生物材料56
• 3.1.2 主要试剂56
• 3.1.3 基础培养基56
• 3.1.4 仪器设备56
• 3.2 方法56-59
• 3.2.1 菌株SL-30生物量和发酵液杀螺活性变化曲线测定56-57
• 3.2.2 杀螺活性测试57
• 3.2.3 单因素试验57
• 3.2.4 PLACKETT-BURMAN试验57-58
• 3.2.5 响应面试验设计58-59
• 3.2.6 模型验证59
• 3.3 结果与分析59-71
• 3.3.1 菌株SL-30生物量和发酵液杀螺活性随时间变化的测定59-60
• 3.3.2 单因素试验结果60-65
• 3.3.3 PLACKETT-BURMAN试验结果65-66
• 3.3.4 BOX-BEHNKEN响应面优化结果66-70
• 3.3.5 模型验证70-71
• 3.4 本章小结与讨论71-72
• 第四章 杀螺有效成分的分离及鉴定72-94
• 4.1 材料72-73
• 4.1.1 生物材料72
• 4.1.2 主要试剂72
• 4.1.3 仪器设备72-73
• 4.2 方法73-77
• 4.2.1 菌株SL-30发酵液系统分离73
• 4.2.2 乙醚极性部位杀螺活性成分的分离纯化73-75
• 4.2.3 MI的杀螺活性验证75
• 4.2.4 MI的化学结构鉴定75
• 4.2.5 MI对非靶生物的毒性测试75-77
• 4.3 结果与分析77-92
• 4.3.1 菌株SL-30发酵液杀螺活性部位筛选77-78
• 4.3.2 杀螺有效成分MI的分离纯化78-81
• 4.3.3 MI的杀螺活性81-82
• 4.3.4 MI的化学结构分析82-88
• 4.3.5 MI对非靶生物的毒性88-92
• 4.4 本章小结与讨论92-94
• 第五章 有效成分MI对钉螺组织及细胞的形态结构影响94-104
• 5.1 材料94-95
• 5.1.1 生物材料94
• 5.1.2 主要试剂94
• 5.1.3 主要仪器94-95
• 5.2 方法95
• 5.2.1 钉螺的浸杀处理95
• 5.2.2 细胞凋亡形态检测95
• 5.2.3 组织形态观察95
• 5.2.4 细胞超微结构观察95
• 5.3 结果与分析95-103
• 5.3.1 MI对钉螺细胞凋亡的影响95-96
• 5.3.2 MI对组织形态的影响96-98
• 5.3.3 MI对钉螺细胞超微结构的影响98-103
• 5.4 本章小结与讨论103-104
• 第六章 有效成分MI对钉螺部分酶活力的影响104-122
• 6.1 材料104-105
• 6.1.1 生物材料104
• 6.1.2 主要试剂104-105
• 6.1.3 主要仪器105
• 6.2 方法105-107
• 6.2.1 钉螺处理105
• 6.2.2 酶的提取105-106
• 6.2.3 酯酶同工酶电泳106-107
• 6.2.4 酶活测定107
• 6.2.5 数据处理107
• 6.3 结果及分析107-119
• 6.3.1 杀螺有效成分MI对钉螺酯酶同工酶的影响107-109
• 6.3.2 杀螺有效成分MI对钉螺部分酶活的影响109-119
• 6.4 本章小结与讨论119-122
• 第七章 菌株SL-30的生物安全性初步检测122-132
• 7.1 材料122-123
• 7.1.1 生物材料122
• 7.1.2 主要试剂122
• 7.1.3 仪器设备122-123
• 7.2 方法123-124
• 7.2.1 菌株SL-30孢子在水体中的检测123
• 7.2.2 菌株SL-30孢子对鱼虾安全性试验123
• 7.2.3 小鼠经口急性毒性试验123
• 7.2.4 大鼠经皮急性毒性试验123-124
• 7.2.5 大鼠吸入急性毒性试验124
• 7.2.6 病理切片观察124
• 7.2.7 数据处理124
• 7.3 结果与分析124-131
• 7.3.1 菌株SL-30孢子在水体中的存活结果124-125
• 7.3.2 菌株SL-30孢子对鱼虾的安全性测定结果125-126
• 7.3.3 小鼠急性经口毒性126-127
• 7.3.4 大鼠急性经皮毒性127-129
• 7.3.5 大鼠急性吸入毒性129-131
• 7.4 本章小结与讨论131-132
• 第八章 菌株接种土壤环境的杀螺作用初探132-144
• 8.1 材料132-133
• 8.1.1 生物材料132
• 8.1.2 主要试剂132-133
• 8.1.3 仪器设备133
• 8.2 方法133-135
• 8.2.1 菌株SL-30接种非根周土的杀螺活性测定133-134
• 8.2.2 菌株SL-30接种植物根周环境的杀螺活性测定134-135
• 8.2.3 数据处理135
• 8.3 结果与分析135-142
• 8.3.1 接种非根周土的杀螺活性结果135-138
• 8.3.2 接种根周环境的杀螺活性结果138-142
• 8.4 本章小结与讨论142-144
• 第九章 论文创新点、主要结论及工作展望144-146
• 参考文献146-162
• 致谢162-163
• 学习期间发表的论文163

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