血管内皮祖细胞逆转骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的研究

发布时间：2017-11-06 02:29

  本文关键词：血管内皮祖细胞逆转骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的研究

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【摘要】：研究背景:绝经后骨质疏松(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是由于女性绝经后雌激素合成和分泌不足致使骨形成和骨吸收代谢失衡,骨丢失,骨密度降低造成的一种常见的全身性疾病。研究证实雌激素水平降低是造成PMOP的重要原因,导致牙槽骨吸收加快,牙齿缺失,牙周组织的再生与修复困难。近年来随着骨组织工程的深入研究,应用骨髓间充质干细胞(BMSCs)修复颌骨、牙槽骨缺损取得了较大进展。然而,国内外研究发现,雌激素缺乏的微环境会导致BMSCs凋亡增加以及骨向分化能力降低,此时依靠单纯BMSCs植入来修复骨缺损,由于缺乏必要的营养支持和适宜的局部微环境,从而导致其生存能力降低。综上,应用干细胞移植方法来修复骨缺损能够成功的关键是提高移植物中BMSCs的存活率并保持其干细胞的特性。近年来研究发现EPCs具有特异性归巢的能力,能通过自身的分化、增殖形成新生血管,对改善微环境具有独特的优越性。本实验旨在通过建立血管内皮祖细胞(EPCs)与去势大鼠骨髓间充质干细胞(OVX-BMSCs)transwell间接共培养体系,来探明EPCs是否能够逆转OVX-BMSCs的生物学特性,以奠定临床骨质疏松患者牙槽骨修复的理论基础。研究目的:本实验应用大鼠血管内皮祖细胞(EPCs)与去势大鼠骨髓间充质干细胞(OVX-BMSCs)进行体外transwell间接共培养,观察EPCs对OVX-BMSCs增殖、凋亡及分化特性的影响,为临床修复骨质疏松患者的牙槽骨缺损提供理论依据。研究内容:(1)去势大鼠骨质疏松模型的建立。(2)假手术组和去势组大鼠BMSCs的分离、培养及鉴定;假手术组大鼠EPCs的分离、培养及鉴定。(3)在transwell间接共培养条件下,研究EPCs对OVX-BMSCs增殖、凋亡及分化能力的影响。研究方法:(1)建立去势大鼠骨质疏松模型:造模的方法是选择适合月龄(3月龄)的雌性大鼠,用10%水合氯醛经腹腔注射麻醉,选用背部双侧切口,钝性分离进腹腔,沿输卵管逆行确定卵巢位置后丝线结扎将其切除,结扎残端、依次缝合切口。假手术组仅切除卵巢周围等量的脂肪组织。术后3个月,采用micro-CT扫描股骨对大鼠模型进行评估。(2)EPCs的分离培养:本实验利用percoll淋巴细胞分离液经密度梯度离心获取假手术组大鼠骨髓单个核细胞,通过差速贴壁结合特殊内皮细胞培养基扩增来诱导内皮细胞的分化,通过倒置相差显微镜观察细胞形态,双荧光免疫染色法检测内皮细胞功能,应用流式细胞仪进行分子表型鉴定。(3)BMSCs的分离培养:本实验采用密度梯度离心法结合贴壁法来分离培养去势组和假手术组大鼠BMSCs;于倒置相差显微镜下观察BMSCs细胞形态,应用流式细胞仪技术检测分子表型,进行成骨成脂诱导进一步鉴定其干性。(4)建立EPCs和OVX-BMSCs间接共培养体系并进行相关检测:实验组为EPCs和OVX-BMSCs以相同的密度分别接种于transwell底膜和6孔板底,并设置单纯去势组BMSCs和单纯假手术组BMSCs接种作为2组对照组。间接共培养条件下,利用流式细胞仪分别检测实验组和对照组BMSCs的增殖能力和凋亡率;ALP染色、茜素红染色观察三组BMSCs矿化结节的形成,Real-time PCR方法检测三组BMSCs成骨基因的表达情况;油红O染色观察三组BMSCs脂滴形成情况,Real-time PCR方法检测三组BMSCs成脂基因的表达。研究结果:(1)去势大鼠手术三个月后,micro-CT扫描结果显示去势组骨小梁排列明显较假手术组稀疏,骨小梁密度减小,间隙增加。分析两组大鼠骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)及骨表面积和骨体积比(BS/BV)显示去势组和假手术组相比两者有显著性差异(P0.01),由此可证明本实验中SD雌性大鼠去卵巢骨质疏松模型造模成功。(2)本实验中采用密度梯度离心法结合差速贴壁法,利用内皮细胞条件培养基诱导EPCs的生长,通过倒置相差显微镜观察细胞形态,呈典型的“铺路石”状,应用流式细胞仪技术进行细胞表型鉴定,结果显示细胞高表达造血干细胞和内皮细胞标志物,细胞双荧光染色阳性,表明培养细胞为EPCs。(3)本实验中采用密度梯度离心法结合贴壁法分离培养BMSCs,倒置相差显微镜下观察细胞形态呈长梭型,诱导细胞成骨、成脂分化,并且通过流式细胞仪检测细胞表型,结果表明培养的细胞高表达间充质干细胞表面标记,几乎不表达造血干细胞表面标记,表明培养的细胞为BMSCs。(4)在间接共培养条件下,应用流式细胞仪检测三组BMSCs的增殖能力和凋亡率,结果显示EPCs与OVX-BMSCs间接共培养组的S期细胞数显著大于去势组BMSCs S期细胞数,且大于假手术组BMSCs S期细胞数(P0.05);共培养组OVX-BMSCs细胞凋亡率显著小于去势组BMSCs凋亡率,且小于假手术组BMSCs凋亡率(P0.05)。ALP染色和茜素红染色结果显示共培养组OVX-BMSCs的矿化结节形成多于去势组和假手术组,Real-time PCR检测结果显示共培养组OVX-BMSCs成骨基因Runx2、OCN、BSP的表达水平比去势组BMSCs明显上调,跟假手术组BMSCs相比也明显上调(P0.05)。油红O染色结果显示共培养组OVX-BMSCs的脂滴形成多于去势组和假手术组,Real-time PCR检测结果显示共培养组OVX-BMSCs成脂基因LPL、PPARγ2的表达水平比去势组BMSCs明显上调,跟假手术组BMSCs相比也明显上调(P0.05)。结论:(1)选用3月龄SD雌性大鼠行双侧卵巢摘除,术后3个月micro-CT扫描结果及相关分析显示成功建立去势大鼠骨质疏松模型。(2)间接共培养条件下,EPCs可逆转OVX-BMSCs的增殖能力,降低其凋亡率。(3)间接共培养条件下,EPCs可逆转OVX-BMSCs的成骨分化能力,增强其成脂分化能力。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R580
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本文编号：1146976