一氧化碳高压干燥保存对小鼠供心冷缺血再灌注损伤的影响的实验研究

发布时间：2017-11-30 15:10

  本文关键词：一氧化碳高压干燥保存对小鼠供心冷缺血再灌注损伤的影响的实验研究

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【摘要】：目的器官移植手术,如肾脏,心脏,肺脏,肝脏的移植,已成为临床经常使用的终末期器官功能衰竭的确实有效的医治手段之一。外科技巧和免疫抑药物运用逐渐成熟,术后看护的日益进步,使器官移植手术成功率及预后不断提高,但随之而来的供体器官不足的问题却日趋凸显。离体供心无法长期保存已成为限制心脏来源,遏制心脏移植手术开展的重要瓶颈。如何进一步延长供心保存时限,扩大供心来源,已经成为当今世界各国心脏研究中心研究的热点之一。近几十年来,研究人员通过体内外实验探索过的心脏离体保存法包括简单低温保存,低温高压氧保存,持续灌注保存,间歇灌注保存及深低温保存等[1]。上诉各保存方法均能在一定程度上延长供心保存时间,它们在保存过程中,均需将心脏浸泡保存于心脏停跳液中,利用心脏停跳液作为心脏体外保存的媒介。但在离体供心保存时,由于缺血缺氧环境,ATP生成障碍,导致心肌细胞膜上钠钾泵失活,导致细胞内外渗透压发生改变,导致心肌纤维产生水肿及不可逆的损伤,故心脏的离体保存时间尚未能取得突破性的进展。虽然,通过改良保存液的方式,如往保存液中添加葡萄糖、谷氨酸、抗氧化剂及钙离子通道拮抗剂等,能部分减少保存过程中的不良影响,但其效果并不理想。当前,公认的心脏有效保存时间仅为4h-6h[2]。一氧化碳(Carbon monoxide, CO)是一种无色无味的惰性气体,研究发现C0具有第二信使的作用,是一种重要的信号分子,在全身多个器官系统中发挥着重要的调节作用。大量研究表明C0可作为一种新的抗凋亡气体运用于器官移植领域,多个体内外实验将C0运用于大鼠的心,肺,肝,肾,小肠,肾脏等器官,在减轻器官缺血再灌注损伤(Ischemia-reperfusion injury, IRI)方面均取得了良好的效果。目前,国内针对C0对供体心脏保护作用的研究大都采用化学药物体内诱导的方法,常见的有利用二氯甲烷(Methylene chloride, MC)等诱导剂喂食小鼠,促进小鼠体内内源性的CO气体生成,可将供心保存时间延长至8-10h。若利用CO的生物学特性,通过改良供心保存方法,建立一种有效心脏长期保存方法,将大大的提高心脏移植手术的成功率及预后,为广大终末期心脏病患者带来新的希望。本课题选用一氧化碳高压干燥保存这一崭新的心脏保存方式来保存小鼠离体心脏,以探讨这一方法对小鼠供心冷缺血再灌注损伤的保护作用效果,并研究其相关作用机制。方法选取健康雄性C57BL/6小鼠,通过建立同系小鼠心脏颈部异位移植模型来观察供心移植后改变。供体鼠选用4-6W C57BL/6小鼠48只,随机分为4组(n=12),即A组：空白对照组,B组：即刻移植组,C组：HTK保存组,D组：CO高压干燥保存组；受体鼠选用8-10w C57BL/6小鼠36只,随机分为3组(n=12),分别作为即刻移植组、HTK保存组,CO高压干燥保存组的受体。供体小鼠处理：4～6w供体组小鼠,麻醉成功后,剪开腹壁,充分暴露下腔静脉,经下腔静脉注射4℃肝素水1ml (100u/ml)。剪开胸壁及膈肌暴露心脏,经下腔静脉向心脏缓慢注射高钾停搏液,直至心脏停跳。分离并将心肺联合取下。将分离后心肺组织快速放置于盛有4℃冰冻肝素生理盐水的培养皿中。供心处理：显微镜下修整供心,除肺动脉及主动脉外,余各个心脏血管均予结扎。用弯头显微镊经左右心耳小切口进入左右心房腔,钝性分离房间隔,联通左右心房。经主动脉残端置管,缓慢逆行灌注保存液(根据分组不同,空白对照组、即刻移植组、HTK保存组三组供心灌注HTK液,CO高压干燥保存组供心灌注改良KH液)灌注压力固定为30cmH2O,灌注时间约为2～3min。空白对照组供心处理完后马上取材行相关检查；即刻移植组供心处理完后马上行异位移植手术移植；HTK保存组供心处理完后置于15ml 4℃HTK液中保存24h；CO高压干燥保存组供心处理完成后,主动脉残端留置一灌注管,使主动脉开口处于开放状态,且冠脉内及主动脉残端留置的灌注管内均充满改良KH液,经此处理后供心悬挂于高压气体罐中保存(PO2:3.2×101.325 kPa+PCO:0.8×101.325 kPa=4× 101.325 kPa),并将高压罐放入4℃冰箱24h,注意留意高压罐的气压改变并及时补充不足的气体。建立同系小鼠心脏颈部异位移植模型：8～10w小鼠作为受体鼠,麻醉满意之后,沿小鼠右锁骨中点至右侧颌下纵行剪开颈部皮肤,充分显露并分离右颈内静脉及颈总动脉,于颈动静脉远端结扎,近端予显微血管夹夹闭。采用改良cuff方法,将静脉残端穿入静脉套管后外翻,呈袖套样套于静脉套管壁上,并予10-0丝线固定。肝素生理盐水冲洗静脉腔,将静脉腔内残留组织碎片及血栓祛除。同理处理颈总动脉。受体小鼠准备完毕之后,取出经不同保存条件处理后的供心,将其置于含4℃冰生理盐水的培养皿中进行修整。生理盐水冲洗并排出左右心耳、主动脉及肺动脉内气体,结扎左右心耳切口,取出主动脉残端留置的灌注管,修剪主动脉及肺动脉于合适长度。显微镜下,将受体鼠带套管的颈总动脉套于供心主动脉内,颈内静脉套于肺动脉内,并将主动脉壁及肺动脉壁分别结扎固定于套管壁上。手术完毕后,先开放颈静脉的近心端,再开放颈动脉的进心端,开放后观察供心表面及吻合口是否有渗血及梗阻的情况,并予相应处理。开放后观察供心2h,记录心脏的复跳情况、质地改变及颜色变化。根据供心开放后供心搏动情况,记录供心复跳率；根据供心复灌后收缩强度、颜色及心肌硬度行移植物活力评分,最低0分,满分5分,分数越高代表心肌活力越好,术后供心存活时间越长。观察完毕后,缝皮,受体鼠保温、独笼饲养。术后供心取样检测：除空白对照组小鼠供心处理后即刻取样检测外,余三组供心均于移植后24h取样行相关检测。移植后24h,处死受体小鼠,抽血后分离提取血清,检测血清肌钙蛋白I(Troponin I, TnI)浓度变化；取供心心肌组织,采用苏木精—伊红(hematoxylin-eosinstaining, HE)染色法对组织切片进行染色,对比四组供心心肌细胞排列、细胞间质水肿程度、冠脉血管周围组织改变及炎症细胞浸润程度,缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)检测凋亡染色阳性心肌细胞,并于高倍镜下行凋亡细胞计数,计算凋亡指数,比较各组心肌细胞凋亡程度,采用行蛋白免疫印迹法(Western-blot, WB)检测B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma 2, Bcl-2)的蛋白表达水平,从而推断细胞凋亡改变的可能原因。结果建模成功2h后,于手术显微镜下可见：即刻移植组供心颜色红润,搏动强,窦性心律,心室壁柔软富有弹性,冠脉通畅,未见明显出血、淤血表现。HTK保存组心脏组织颜色多呈黑红色、弹性差,心室壁僵硬,多为无搏动或局部心房搏动,心律失常多见,冠脉内血流淤滞,冠脉周围可见弥漫性出血灶,供心多于移植后24h内停止搏动。CO高压干燥保存组：心脏颜色红稍偏暗,弹性稍差,心室壁稍显僵硬,搏动多为窦性心律,心肌收缩力较即刻移植组减弱,冠脉内血流通畅,冠脉周围可见少量散在出血点。移植物活力评分结果：各组移植物活力评分分别用中位数、第1四分位数(P25%)及第3四分位数(P75%)表示,即刻移植组、HTK保存组及CO高压干燥保存组活力评分分数为5(5-5)、0(0-1)、3(2.25～3.75),差异有统计学意义(P0.01)。调整检验水平α’=α/3=0.0167,行两两比较后发现,即刻移植组活力评分高于HTK保存组及CO高压干燥保存组,差异有统计学意义(p0.01),CO高压干燥保存组评分高于HTK保存组,差异有统计学意义(p0.01)各组供心复跳率结果为：即刻移植组中有10只、HTK保存组中有2只、CO高压干燥保存组中有9只供心移植后复跳(n=12),复跳率分别为83.3%、16.7%、75.0%。三组间差异有统计学意义(z2=13.03,P=0.00150.01)。调整检验水准α'=α/3=0.0167后,行多样本两两比较,CO高压干燥保存组的复跳率与即刻移植组的复跳率差异无统计学意义(P=10.0167),但明显高于HTK保存组,差异有统计学意义(P0.0167)。HTK组复跳率明显低于即刻移植组,差异有统计学意义(X2=10.67, P=0.00110.01)。四组血清肌钙蛋白I浓度分别为：空白对照组：(0.28±0.02)ng/m1,即刻移植组：(0.37±0.03)ng/ml,HTK保存组：(2.02±0.05)ng/ml,CO高压干燥保存组：(1.59±0.04)ng/ml。组间差异有统计学意义(F=6404.74,P0.01),即刻移植组较空白对照组稍升高(P0.001)；CO高压干燥保存组明显高于即刻移植组(P0.001),但低于HTK保存组(P0.001),差异均有统计学意义。四组供心的HE染色对比发现,光学显微镜下,空白对照组供心组心肌细胞染色均一,排列致密,细胞结构完整清晰,间质未见水肿,冠脉壁完整,周围未见明显红细胞渗出；即刻移植组供心心肌组织染色均一,细胞排列有序,细胞结构完成,组织间质稍水肿；HTK保存组供心,可见部分心肌细胞变性,细胞排列紊乱,细胞间可见核深染中性粒细胞浸润,心肌细胞间质可见红细胞渗出；CO高压干燥保存组：供心心肌细胞排列致密,结构完整,排列基本规整,染色较均匀,心肌细胞较完整,心肌细胞间质可见少量中性粒细胞侵润,未见明显红细胞渗出。Tunel检测显示,空白对照组心肌细胞呈均一的淡染,未见异常核。即刻移植组心肌细胞染色均匀,偶见绿色阳性细胞,HTK保存组可见大量绿色阳性凋亡细胞, CO高压干燥保存组可见少量绿色阳性凋亡细胞,但明显少于HTK保存组。空白对照组、即刻移植组、HTK保存组及CO高压干燥保存组凋亡细胞指数分别1.08±0.15、3.96±0.41、15.83±1.33、4.21±0.28,差异有统计学意义(F=1003.67,P0.01)。空白对照组凋亡指数远小于其余三组,差异有统计学意义(P0.01)。即刻移植组凋亡指数小于HTK保存组(P0.01),但与CO高压干燥保存组间差异无统计学意义(P=0.440.05)。CO高压干燥保存组较HTK保存组的凋亡指数明显下降,差异有统计学意义(P0.01)。Western-blot检测发现：空白对照组、即刻移植组、HTK保存组、CO高压干燥保存组的Bcl-2蛋白表达量分别为(0.14±0.01)、(0.18±0.01)、(0.62±0.05)、(0.71±0.05),组间差异有统计学意义(F=750.79,P0.01)。多样本间两两比较后发现,空白对照组Bcl-2蛋白表达量最低,即刻移植组心肌Bcl-2表达低于HTK保存组(P0.01)及CO高压干燥保存组(P0.01),CO高压干燥保存组的心肌细胞Bcl-2蛋白高于HTK保存组(P=0.0030.01),差异均有统计学意义。结论CO高压干燥保存是一种有效的心脏保存方法。该方法可有效延长小鼠供心离体保存时间,减少离体供心冷缺血再灌注损伤,提高移植后供心复跳率。但是,其在供心保存过程中的具体作用机制仍有待进一步研究证实。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R654.2

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