罗仙子初提物的抗衰老药效及其抗氧化机制初探

发布时间：2017-12-02 04:25

  本文关键词：罗仙子初提物的抗衰老药效及其抗氧化机制初探

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【摘要】：衰老是一种自然的,持续发生的变化过程。自由基学说(Free radicle theory,FR)是最具代表性的衰老学说之一,该学说认为自由基损伤人体细胞,从而引起众多疾病,加速人体衰老。抗氧化是预防衰老的重要步骤,抗氧化剂是任何以低浓度存在就能有效抑制自由基氧化反应的物质,开发实用、高效、低毒的天然抗氧化剂是今后研究的重点。中药罗仙子原名家蝇蛆,俗称蛆,其成虫家蝇常出没于污秽之地,置身于不计其数的病菌(包括寄生虫、病毒、细菌、甚至是抗生素耐药的细菌等)之中,却能安然无恙,不被这些病原体感染,这源于其优异的免疫功能。近年来,国内外的研究人员对罗仙子的研究,大多集中在活性肽上,他们发现罗仙子提取物中富含凝集素、溶菌酶、抗菌蛋白等活性成分,具有抗细菌、真菌、病毒等病原体和抗肿瘤细胞的作用。本实验室前期在研究罗仙子提取物对高脂血症大鼠血脂调节及肝脏保护的作用时发现,罗仙子提取物使肝脏匀浆中超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)的活性明显升高,丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平明显下降,提示罗仙子提取物可能具有通过清除自由基来增强抗氧化能力的作用。随着研究的深入,一些研究还发现了罗仙子提取物可以清除自由基和抵抗重金属胁迫,但是大多都只是研究了家蝇幼虫初提物的清除自由基方面。本研究通过D-半乳糖(D-galactose,D-gal)致衰老小鼠模型和自然衰老大鼠模型对罗仙子初提物的抗衰老药效进行评价并初步探讨其抗氧化机制,在此基础上,初步摸索了罗仙子初提物的酶解工艺,为从传统中药罗仙子中开发出一种抗衰老候选药物分子提供理论基础,也为罗仙子抗氧化肽的提取分离打下基础。实验方法:1.利用D-半乳糖诱导小鼠模型评价罗仙子初提物的抗衰老药效及其抗氧化机制昆明小鼠48只,随机分为正常对照组、衰老模型组、维生素E(Vitamin E,Vit E)对照组和罗仙子初提物低、中、高剂量组,每组8只。除正常对照组外,其余各组均按10 mg/kg给予D-gal颈背部皮下注射,每日一次,连续注射6周,同时Vit E组和罗仙子初提物低、中、高剂量组按10 ml/kg灌胃给药。造模给药0 d始,每天测定小鼠的体重,并观察各组小鼠形态行为学的改变;造模给药第30 d时,进行小鼠避暗实验;造模给药6周后处死小鼠,检测小鼠血清、肝脏和脑组织中各项抗氧化相关指标。2.利用自然衰老大鼠模型评价罗仙子初提物的抗衰老药效及其抗氧化机制10-11月龄的大鼠在SPF环境饲养9个月,饲养至19-20月龄,随机分为5组,分别为:衰老模型组、Vit E对照组和罗仙子初提物低、中、高剂量组,每组8只。青年对照组在衰老模型组的大鼠造模且临近给药的前10天购进,适应性饲养10天。罗仙子初提物各剂量组和Vit E组按10 ml/kg,灌胃给药,每日一次,连续2个月。青年对照组和衰老模型组给予同体积的生理盐水。造模给药0 d始,每月测定大鼠的体重,并观察各组大鼠形态学的改变;给药结束进行Morris水迷宫实验后,大鼠注射乙醚麻醉,腹主动脉取血;取血后迅速取出脑组织。3.初步酶解罗仙子初提物利用Alcalase碱性蛋白酶对罗仙子初提物进行酶解,高效液相色谱分析(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)酶解前后组分差异,并测定其清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl),DPPH·)自由基的活性;在此基础上,采用单因素分析酶解条件(具体为p H、温度、底物浓度、加酶量和酶解时间等)对酶解的影响。实验结果:1.利用D-半乳糖诱导小鼠模型评价罗仙子初提物的抗衰老药效及其抗氧化机制与正常对照组相比,衰老模型组小鼠体重增加速率明显减慢,学习记忆能力明显减退,小鼠血清,肝脏,脑组织中的SOD活性和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)活力均降低,MDA含量增加。与衰老模型组相比,Vit E组和罗仙子初提物各剂量组体重增加速率升高,学习记忆能力增强,小鼠血清,肝脏,脑组织中的SOD活性升高,MDA含量减少,GSH-PX活力增强。2.利用自然衰老大鼠模型评价罗仙子初提物的抗衰老药效及其抗氧化机制与青年对照组相比,衰老模型组大鼠活动缓慢,皮肤污秽无泽,体重随周龄的增加不明显;Morris水迷宫定向航行实验中存在潜在的学习记忆功能障碍;大鼠脑组织超微结构中神经元胞质,胞体和突起中出现溶酶体;胞体中线粒体出现肿胀,线粒体中嵴的溶解和消失;粗面内质网扩张,网腔的扩张,游离核糖体密度降低,数量减少,分布不均,呈不规则排列,扭曲和膨胀,且有部分游离到了细胞质中;神经突触间隙及突触前、后膜结构模糊,神经突触连接变少;脑组织中SOD活性和GSH-PX活力降低,MDA含量升高。与衰老模型组相比,Vit E组和罗仙子初提物各剂量组体重随周龄增加,学习记忆功能障碍减轻,大鼠脑组织超微结构中神经元胞质,胞体和突起中溶酶体数量减少;胞体中线粒体肿胀减弱,线粒体中嵴的溶解情况也得到了缓解;神经突触间隙及突触前、后膜结构较清晰;脑组织中的SOD活性升高,MDA含量减少,GSH-PX活力增强。3.初步酶解罗仙子初提物对罗仙子初提物进行酶解后,通过HPLC上样分析和测定其清除DPPH·自由基活性发现,酶解前后的罗仙子初提物的色谱图谱存在差异,且酶解后的罗仙子初提物具有更好的清除DPPH·的活性。通过后续对酶解条件进行优化时发现,酶解时的底物浓度,酶解p H和酶解温度对酶解效率的影响较大,而加酶量和酶解时间对酶解效率的影响较小。结论:本研究分别利用D-gal致亚急性衰老小鼠模型和自然衰老大鼠模型综合评价罗仙子初提物的抗衰老药效,实验结果显示,D-gal致亚急性衰老小鼠模型及自然衰老组大鼠与正常对照组对比,均出现衰老的症状;而罗仙子各剂量组和Vit E组的实验动物衰老症状均有所减轻;通过观察各组实验动物行为,测定体内抗氧化相关指标,检测超微结构等,分析发现罗仙子初提物可能通过清除自由基等作用来提高机体的抗氧化能力,进而改善超微结构的一些衰老症状,从而达到延缓衰老的作用。对罗仙子初提物进行初步酶解后,通过HPLC上样分析和测定其清除DPPH·自由基活性发现,酶解前后的罗仙子初提物的色谱图片存在差异,说明罗仙子初提物酶解后,确实水解出了某些具有抗氧化活性的小分子多肽。通过后续初步对酶解条件的优化发现,酶解时底物浓度,酶解p H和酶解温度对酶解效率的影响较大,而加酶量和酶解时间对酶解效率的影响较小。上述结果为从传统中药罗仙子中开发出一种抗衰老候选药物分子提供理论基础,也为罗仙子抗氧化肽的提取分离打下基础。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R285

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3 韩U，

本文编号：1243641