UCP2参与血管紧张素Ⅱ诱导ApoE敲除小鼠腹主动脉瘤形成机制

发布时间：2018-01-21 01:41

  本文关键词： 解耦连蛋白2 腹主动脉瘤 抗氧化 抗细胞凋亡　出处：《西南医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:目前研究提示腹主动脉瘤(AAA)形成机制包括炎症反应、基质降解和重塑都与活性氧(ROS)有一定程度的关系,线粒体解偶联蛋白2(UCP-2)被认为是抗氧化剂,位于线粒体内膜的阴离子载体,在多个组织都有表达,通过维持活性氧的平衡防止氧化损伤;UCP-2在不同的细胞已经被确定为凋亡抑制基因,主动脉瘤及夹层已被证实存在血管平滑肌细胞凋亡;因此,我们认为UCP-2是一个关键因素,通过抗氧化和抗凋亡抑制AAA的形成。为了确定这一假设,通过UCP-2和载脂蛋白E(Apo E)双基因敲除小鼠测定UCP-2在AAA的病理作用。方法:1、UCP-2~(-/-)Apo E~(-/-)双敲小鼠由UCP-2~(-/-)与Apo E~(-/-)小鼠杂交产生,PCR法检测基因敲除小鼠的基因分型,DNA样本取自小鼠尾部;2、实验分组:野生小鼠(WT)、单基因敲除小鼠(Apo E~(-/-))、双基因敲除小鼠(UCP-2~(-/-)Apo E~(-/-));3、腹主动脉瘤造模:选择8周龄雄性小鼠吸入异氟醚麻醉后,将含有血管紧张素II(1000ng/kg/min;Sigma)的微型渗透泵(Alzet,2004)置于小鼠背部皮肤下持续4周;4、采用q RT PCR和蛋白免疫印迹试验的方法检测WT、Apo E~(-/-)、Apo E~(-/-)+Ang-Ⅱ各组腹主动脉UCP2 mRNA和蛋白的表达情况;5、通过HE、VVG、-SMA染色的方法检测小鼠造模4周后腹主动脉外膜增厚、弹性纤维、平滑肌细胞情况;6、采用蛋白免疫印迹试验(Western blotting)检测各组MMP2、MMP9炎症因子在腹主动脉瘤的表达;7、通过超氧化物阴离子荧光探针(DHE)染色评估活性氧(ROS)水平,用荧光显微镜490 nm和590 nm发射的激发波长观察。活性氧ROS的荧光强度用Image J图像处理软件进行定量;通过NADPH氧化酶活性、丙二醛(MDA)浓度和超氧化物歧化酶(SOD)活性测定氧化应激水平,组织匀浆用二亚苯基碘(DPI)检测NADPH氧化酶活性,硫代巴比妥酸(TBA)检测丙二醛,硝基四氮唑蓝(NBT)检测SOD活性;8、TUNEL法检测腹主动脉瘤细胞凋亡情况,在细胞凋亡过程中,会激活一些DNA酶使基因组DNA断裂,暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Td T)的催化下结合绿色荧光探针的荧光素(FITC)标记的d UTP,通过荧光显微镜检测到;半胱天冬酶-3(caspase 3)是参与执行细胞凋亡的一个关键酶,在凋亡的早期阶段被激活,裂解相应的胞核底物,最终导致细胞凋亡。通过caspase 3蛋白免疫印迹检测表达;结果:1、实验结果提示UCP-2 mRNA及蛋白的表达在Ang-Ⅱ诱导的Apo E~(-/-)造模小鼠均明显增高,表明腹主动脉瘤UCP-2的表达变化发生在翻译和转录水平;2、通过血管紧张素Ⅱ处理后,UCP-2~(-/-)Apo E~(-/-)双敲小鼠腹主动脉瘤的发生率(83.9%,26 of 31)明显高于UCP-2+/+Apo E~(-/-)小鼠(55%,11 of 20),并且UCP-2~(-/-)Apo E~(-/-)小鼠主动脉明显扩张,组织学研究显示腹主动脉外膜肥厚,弹性纤维断裂和平滑肌细胞减少;3、通过荧光染料DHE染色检测,UCP-2~(-/-)Apo E~(-/-)双敲小鼠主动脉活性氧增加,UCP-2~(-/-)Apo E~(-/-)双敲小鼠NADPH氧化酶活性和MDA水平明显高于UCP-2+/+Apo E~(-/-)或野生型小鼠,此外,UCP-2+/+Apo E~(-/-)小鼠与野生型小鼠相比SOD活性增加,而UCP-2~(-/-)Apo E~(-/-)双敲小鼠SOD活性增加减少,表明UCP-2对血管紧张素-Ⅱ诱导的氧化应激和腹主动脉瘤形成起保护作用。研究结果还表明UCP-2基因敲除上调主动脉瘤MMP2和MMP9的表达;4、TUNEL法检测细胞凋亡,结果发现在UCP-2~(-/-)Apo E~(-/-)小鼠中Ang-Ⅱ诱导VSMCs凋亡增加,并且在UCP-2~(-/-)Apo E~(-/-)小鼠血管组织caspase-3蛋白表达明显增加;结论:研究表明,在血管紧张素Ⅱ诱导的腹主动脉瘤造模小鼠中,UCP-2mRNA及蛋白的表达均明显增高,缺乏UCP-2通过增加活性氧水平与血管平滑肌细胞凋亡,增加腹主动脉瘤易感性及严重程度,表明UCP-2可以作为被抗氧化剂和抗凋亡因素预防腹主动脉瘤。
[Abstract]:Objective: the present study suggests that abdominal aortic aneurysm (AAA) formation mechanism including inflammation, matrix degradation and remodeling with reactive oxygen species (ROS) have a certain degree of mitochondrial uncoupling protein 2 (UCP-2) is considered as antioxidants, located in the inner mitochondrial membrane anion carrier, in a number of organizations have expressed, prevent oxidation damage by maintaining active oxygen balance; UCP-2 has been identified in different cell apoptosis suppressor gene, aortic aneurysm and dissection has been confirmed the presence of apoptosis of vascular smooth muscle cells; therefore, we think that UCP-2 is a key factor, through the formation of antioxidant and anti apoptosis of AAA. In order to confirm this hypothesis, and by UCP-2 apolipoprotein E (Apo E) double knockout mice were UCP-2 in the pathological role of AAA. Methods: 1, UCP-2~ (- / -) Apo (- / -) E~ double knockout mice by UCP-2~ and Apo (- / -) E~ (- / -) mice were generated by PCR assay. 娴嬪熀鍥犳暡闄ゅ皬榧犵殑鍩哄洜鍒嗗瀷,DNA鏍锋湰鍙栬嚜灏忛紶灏鹃儴;2,瀹為獙鍒嗙粍:閲庣敓灏忛紶(WT),鍗曞熀鍥犳暡闄ゅ皬榧，

本文编号：1450071