水凝胶对骨髓间充质干细胞在皮肤移植模型和心肌梗死模型中滞留率的影响

发布时间：2018-01-21 06:53

本文关键词： 皮肤移植人骨髓间充质干细胞免疫耐受心肌梗死大鼠骨髓间充质干细胞心功能　出处：《苏州大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分：骨髓间充质干细胞联合水凝胶对同种异体皮肤移植的作用目的：联合水凝胶探讨骨髓间充质干细胞对移植皮肤的作用。方法：（1）人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的培养和鉴定，并经CM-DiL染色进行标记。（2）选用雄性的C57BL/6小鼠作为皮肤移植的供体，雄性ICR小鼠作为皮肤移植的受体建立同种异体皮肤移植的动物模型(3)术后将ICR小鼠（受体）随机分为4组，每组10只，分别给予以下处理：在空白组中，单纯给予300ul PBS皮下注射；在水凝胶处理组中，单纯给予300ul水凝胶皮下注射；在细胞处理组中，单纯给予受体人BMSCs溶液300ul移植皮下注射；在联合处理组中，给予受体水凝胶和BMSCs的300ul混合液皮下注射。（4）观察受体移植皮片的存活状况,在术后第9天制作移植皮片的冰冻切片，经荧光显微镜观察体内细胞存活数量：术后开始观察移植皮片的存活时间和状况；开始同时观察的皮片中骨髓间充质干细胞的存活数量（5）人骨髓间充质干细胞在受体ICR鼠的体内分布情况检测：术后第5、9、14天将受体的心、肝、脾、肺、肾等主要脏器制作成冰冻切片，观察间充质干细胞的迁移数量。（6）受体ICR小鼠外周血中炎症因子的测定：术后第14天取外周血，应用ELISA检测外周血中，炎症因子IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α的含量。结果：（1）人BMSCs呈贴壁克隆样生长，流式细胞仪显示P3代的MSCs阳性表达CD29（细胞整合素分子，94.86%）、CD90（Thr-1分子，94.06%）、CD73（89.64%）、CD105（94.98%）和CD44（粘附分子,99.2%）；但低表达造血干细胞表面标志CD34（0.84%），CD11B（1.43%）、CD31（10.86%）、CD45（1.28%）。证明本实验运用全骨髓差异贴壁法培养的细胞特异表达MSC的表面抗原。(2)移植术后观察受体皮肤存活的情况：各组1-4d没有明显变化。在空白组中，第5d出现局部皮肤变黑，8d后皮肤结痂坏死；在水凝胶处理组中，第6d可见局部皮肤小溃疡，9d后皮肤出现结痂坏死；在细胞处理组中，第8d局部皮肤出现小溃疡，第9d局部皮肤变黑，11d后皮肤发生结痂坏死；在联合处理组中，第10d出现局部皮肤小溃疡，第12d出现局部皮肤变黑，13d后皮肤发生结痂坏死。在细胞处理组和联合处理组中，皮肤移植物的存活时间均比空白组长，具有统计学差异（P0.05）；在水凝胶处理组中，皮肤存活时间的比细胞处理组短，差异具有统计学意义（P0.05）；联合处理组与空白组、细胞处理组和水凝胶处理组三组分别比较，皮肤移植物的存活时间均延长，且差异具有统计学意义（P0.05）；联合处理组的皮片存活最长可达18d。（3）观察各组受体小鼠皮下人BMSCs的滞留量：结果显示：在联合处理组中，受体皮下组织中滞留的人BMSCs最多。（4）观察受体体内的人BMSCs的分布情况：结果发现：皮下直接注射后9天后，受体的肺脏组织内依然可以观察到荧光显示的核蓝染胞质红染的骨髓间充质干细胞，心、肝、肾内观察不到上述荧光显示的骨髓间充质干细胞，但是脾脏内在第5天，可以观察到少量上述荧光显示的人骨髓间充质干细胞。（5）ELISA检测受体小鼠外周血细胞因子(IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α)的检测结果： IL-2浓度(pg/ml)各组分别为：1784.16±357.86、1013.62±25.71、671.11±187.53、482.47±33.13，空白组中， IL-2的含量高于细胞处理组（3739.59±493.21）异具有统计学意义（P0.05),在水凝胶处理组中，IL-2的含量明显高于细胞处理组和联合处理组（P0.05); IL-4浓度(pg/ml)各组分别为：24.22±19.94、114.72±50.33、192.45±69.03、444.37±36.73，空白组中，IL-4含量明显低于细胞处理组和联合处理组（P0.05),在水凝胶处理组中，IL-4的含量明显低于细胞处理组和联合处理组（P0.05)，在细胞处理组中，IL-4的含量明显低于联合处理组（P0.05)； IL-10浓度(pg/ml)各组分别为：11.22±3.67、11.77±8.23、28.46±8.91、69.36±11.53，在空白组中，IL-10的含量明显低于细胞处理组和联合处理组（P0.05),在水凝胶处理组中，IL-10的含量明显低于细胞处理组和联合处理组（P0.05)，在细胞处理组中，IL-10的含量明显低于联合处理组（P0.05)；④IFN-γ浓度(pg/ml)各组分别为：6303.27±1458.59、5649.58±1117.06、3303.21±496.61、2292.68±641.48，空白组中，IFN-γ的含量明显低于细胞处理组和联合处理组（P0.05),在水凝胶处理组中，IFN-γ的含量明显低于细胞处理组和联合处理组（P0.05)，细胞处理组中IFN-γ的含量明显低于联合处理组（P0.05)；⑤IFN-γ浓度(pg/ml)各组分别为：1443.79±209.06、793.20±241.99、331.02±108.12、107.46±45.14，空白组中TNF-α的含量明显高于细胞处理组和联合处理组（P0.05),水凝胶处理组中TNF-α的含量明显高于细胞处理组和联合处理组（P0.05)，，细胞处理组中TNF-α的含量明显高于联合处理组（P0.05)。结论：（1）人骨髓间充质干细胞能够明显延长移植物在受体上的存活时间；（2）水凝胶能提高人骨髓间充质干细胞在受体移植皮片中的滞留率从而提高人骨髓间充质干细胞的疗效。第二部分：骨髓间充质干细胞联合水凝胶对心肌梗死的作用目的：验证水凝胶促进骨髓间充质干细胞对心肌梗死的作用。方法：（1）SD大鼠骨髓间充质干细胞培养及鉴定(2)大鼠心梗模型的建立：取20只雄性SD大鼠，分为假开胸组（n=4）,空白组（n=4），水凝胶处理组(n=4)，细胞处理组(n=4)，联合处理组(n=4)，常规麻醉，固定大鼠，气管切开插管，开胸，找到前降支，结扎，心梗建立成功，逐层关胸后拔气管插管。比较结扎前后心电图，心超变化。结果：（1）大鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定结果：CD29、CD90阳性，CD34、CD45、CD106阴性。(2)各组大鼠心功能的观察：在空白组，大鼠的射血分数（EF）和缩短分数（FS）在注射后持续降低，其它三组，EF和FS在注射后前7天降低，但是28天后，都有升高，尤其是联合处理组有明显地升高（P0.05）。结论：水凝胶能提高大鼠骨髓间充质干细胞在心肌梗死中的疗效。
[Abstract]:The first part : The effect of bone marrow mesenchymal stem cells combined with hydrogel on allogeneic skin transplantation Objective : To investigate the effect of bone marrow mesenchymal stem cells ( MSCs ) on skin graft . Methods : ( 1 ) The bone marrow mesenchymal stem cells were cultured and identified and marked by CM - DiL staining . ( 2 ) Male C57BL / 6 mice were randomly divided into 4 groups . Results : ( 1 ) The expression of CD29 ( integrin molecule , 94.86 % ) , CD90 ( Thr - 1 ) , CD105 ( 94.06 % ) , CD73 ( 89.64 % ) , CD105 ( 94.98 % ) and CD44 ( 99 . 2 % ) were detected by flow cytometry . ( 2 ) The survival time of skin grafts was observed after transplantation : 1 - 4 days in each group were not significantly changed . In the blank group , the skin became dark after day 8 , and the skin became necrotic after 8 days . In the treatment group , the survival time of skin grafts was longer than that of the blank group , and the difference was statistically significant ( P0.05 ) . The survival time of skin grafts was prolonged and the difference was statistically significant ( P0.05 ) . The results showed that the content of IL - 2 was significantly lower in the treated group than that in the treatment group and the combined treatment group ( P0.05 ) . The levels of IL - 4 in the treated group were significantly lower than those in the treatment group and the combined treatment group ( P0.05 ) . Conclusion : ( 1 ) Human bone marrow mesenchymal stem cells can obviously prolong the survival time of the graft on the recipient ; ( 2 ) the hydrogel can improve the retention rate of human bone marrow mesenchymal stem cells in the receptor graft skin , so as to improve the curative effect of human bone marrow mesenchymal stem cells . Part Two : Effect of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Combined with Hydrogel on Myocardial Infarction Objective : To verify the effect of hydrogel on bone marrow mesenchymal stem cells ( MSCs ) on myocardial infarction . Methods : ( 1 ) The rat bone marrow mesenchymal stem cells were cultured and identified ( 2 ) establishment of rat heart stem model : 20 male SD rats were divided into sham open chest group ( n = 4 ) , blank group ( n = 4 ) , hydrogel treatment group ( n = 4 ) , cell treatment group ( n = 4 ) , combined treatment group ( n = 4 ) , general anesthesia , fixed rat , trachea incision and intubation , open chest , anterior descending branch , ligation and myocardial infarction . Results : ( 1 ) The phenotypic identification results of bone marrow mesenchymal stem cells in rats were as follows : CD29 , CD90 , CD34 , CD106 and CD106 were negative . ( 2 ) In the blank group , the ejection fraction ( EF ) and shortening fraction ( FS ) of the rats decreased continuously after injection , while the other three groups , EF and FS decreased 7 days before injection , but after 28 days , there was an increase , especially in the combined treatment group ( P0.05 ) . Conclusion : hydrogel can improve the curative effect of bone marrow mesenchymal stem cells in myocardial infarction .

【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R622.1;R542.22

【参考文献】