TLR8激动剂对树突状细胞的调节及其在肿瘤免疫中的作用

发布时间：2018-01-23 21:23

本文关键词： TLR8 CL075 Poly dT 树突状细胞 Lewis肺癌宫颈癌 Bcl-2 VEGF　出处：《江苏大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的： (1)利用来源于C57BL/6小鼠的树突状细胞系DC2.4,探讨联合应用人TLR8激动剂CL075和TLR7/8调节剂Poly dT后,小鼠TLR8能否被激活以及TLR8激活以后对TLR8以及相关细胞因子如IL-10、IL-12和TNF-a表达的影响； (2)建立小鼠肿瘤模型(Lewis肺癌模型),进一步探讨TLR8激活对肿瘤生长的影响及其抗肿瘤免疫应答的调节机制； (3)利用临床肿瘤标本(人宫颈癌组织)以及相关细胞系(人宫颈癌Hela细胞),观察TLR8在人体癌组织的表达以及TLR8激活以后对肿瘤细胞增殖和生存的影响,以便为以TLR8为靶点的肿瘤免疫治疗提供实验和理论依据。方法： (1)在体外实验中,DC2.4细胞用含有10%小牛血清的RPMI1640培养液常规培养,光学显微镜下观察其经PBS、CL075、Poly dT以及CL075与Poly dT联合用药刺激后的形态学变化；RT-PCR或qPT-PCR、免疫荧光法以及Western-blot检测TLR8在DC2.4的表达与分布；qPT-PCR、ELISA法检测DC2.4经上述药物刺激以后相关细胞因子TNF-α、IL-12和IL-10的表达；MTT比色法检测TLR8激动剂激活受体后对DC2.4抗原提呈功能的影响；qRT-PCR与Western-blot检测经药物刺激后对TLR8受体表达的影响。 (2)在体内实验中,取纯系C57BL/6小鼠,22-24克,雄性,随机分成三组,每组10只。小鼠右侧腹壁消毒后,皮下注射Lewis肺癌细胞3.0×106个细胞/只,建立Lewis肺癌小鼠模型。Lewis细胞接种于小鼠当天即开始给药,PBS、CL075和Poly dT均经腹腔注射给药。CL0750.2μg+Poly dT5μg(低剂量组)每天给药一次,PBS组、CL0752μg+Poly dT50μg(高剂量组)每两天给药一次。接种Lewis肺癌细胞第1天后,隔天用电子天平测量小鼠体重一次,7天后,用脱毛剂对各实验组小鼠进行脱毛,观察肿瘤的生长情况。肉眼观察并按摸皮下结节,用游标卡尺隔天测量1次肿瘤结节的长径a及短径b,单位mm,根据公式V=1/2×axb2估算肿瘤体积。给药后第二十一天,在麻醉状态下断颈处死小鼠,取出肿瘤组织,用电子天平称重,计算每组平均瘤重,qRT-PCR检测小鼠脾脏及引流淋巴结中TLR8、IL-12、TNF-α、IL-10、TGF-βFoxp3的表达,FCM检测小鼠脾脏及引流淋巴结中CDllc+细胞TLR8的表达,FCM检测小鼠脾脏及引流淋巴结中CD3+CD8-IFN-γ+T细胞、CD3+CD8+IFNγ+T细胞以及CD4+CD25+Foxp3+T细胞的比例。 (3)临床标本分析采用病人宫颈癌组织,并结合宫颈癌细胞系进行相关验证工作。人宫颈癌细胞系Hela细胞用含有10%小牛血清的DMEM培养液培养。采用RT-PCR/qRT-PCR、免疫荧光法检测Hela细胞TLR8的表达与分布,流式细胞术、MTT比色法检测TLR8激动剂CL075对宫颈癌细胞周期和细胞凋亡的影响,qRT-PCR检测COX-2.Bcl-2VEGF在经CL075刺激的人宫颈癌细胞株中的表达。取人宫颈癌组织及健康对照组样本,qRT-PCR检钡TLR7、TLR8与Bcl-2或VEGF的表达并分析其相关性,最后综合分析TLR8在人宫颈癌细胞的表达及TLR8激动剂对肿瘤增殖和存活的影响。结果: (1)光学显微镜下观察发现,DC2.4细胞呈梭形、星状和多角形,与成熟的树突状细胞相比,树状突起不长,个体较小,细胞透亮,细胞核清晰。分别用PBS、CL075、Poly dT以及CL075+Poly dT刺激24h后,继续在光镜下观察发现：经CL075+Poly dT联合用药刺激的DC2.4细胞树突增多且伸长,而未刺激、单用CL075或Poly dT刺激的DC2.4细胞树突较短且少。RT-PCR/qPT-PCR.免疫荧光法以及Western-blot分别从mRNA水平和蛋白水平证实DC2.4细胞表达TLR8,而且TLR8主要分布于细胞浆内。通过qRT-PCR口ELISA检测发现,与对照组相比,无论是mRNA水平还是蛋白水平,CL075+Poly dT联合用药组细胞分泌TNF-α和IL-12的水平均显著增加(*p0.05),而IL-10的分泌水平显著降低(*p0.05).尽管CL075处理组细胞TNF-α mRNA、TNF-α蛋白和IL-12mRNA水平也略有增加,但与对照组相比均无统计学意义,而Poly dT处理组DC2.4细胞TNF-α、IL-12和IL-10的mRNA和蛋白表达量均无变化。混合淋巴细胞反应实验发现：与对照组相比,经CL075+Poly dT刺激72h后的DC2.4可促进T淋巴细胞增殖(与对照组相比,**p0.01),且T细胞与DC的比例为5：1时刺激作用更明显。进一步的研究发现,CL075+Poly dT联合处理组的DC2.4细胞中TLR8mRNA和TLR8蛋白的表达量明显高于阴性对照组(*p0.05),CL075或Poly dT单独处理组DC2.4细胞TLR8的表达量与阴性对照组相比无明显变化。 (2)小鼠体内实验结果发现,腹腔注射CL075与Poly dT有效抑制了肿瘤的生长。CL075+Poly dT高剂量组小鼠的肿瘤体积与肿瘤重量明显小于PBS对照组(*P0.05,n=10)。与PBS组相比,CL0752μg+Ply dT50μg(高剂量)组、CL0750.2μg+Poly dT5μg(低剂量)组小鼠体重无明显差别。qRT-PCR检测发现,高剂量CL075+Poly dT可以显著增加荷瘤小鼠脾脏和引流淋巴结IL-12mRNA的表达,引流淋巴结中TNF-α mRNA的表达也显著增加,而抑制性细胞因子IL-10.TGF-βFoxp3的mRNA在脾脏和引流淋巴结中的表达量则明显降低(与对照组相比,*P0.05或**P0.01,n=4)。流式细胞术的实验结果进一步证实,高剂量CL075+Poly dT可以促进脾脏和引流淋巴结中CD3+CD8-IFN-γ+T细胞和CD3+CD8+IFNγ+T细胞的增殖,而明显抑制CD4+CD25+Foxp3+T细胞的增殖(与对照组相比,*P0.05或**P0.01,n=6),证明CL075与PolydT联合应用一方面通过刺激荷瘤小鼠分泌IL-12、TNF-α等细胞因子,诱导Thl型应答和CD8+细胞毒作用,从而增强小鼠的抗肿瘤免疫应答；另一方面,CL075与Poly dT合用,可通过减少荷瘤小鼠体内抑制性细胞因子如IL-10、TGF-β和Foxp3的表达,和抑制CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的增殖而负向调控肿瘤免疫耐受,从而有效增强了荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫应答,延缓了肿瘤的发展进程。本研究同时还发现,与高剂量CL075+Poly dT目比,低剂量CL075+PolydT抑制肿瘤生长和增强抗肿瘤免疫的作用虽然不如高剂量明显,但仍有一定的作用。而且,低剂量CL075+Poly dT可以明显诱导脾脏和引流淋巴结中CDllc+细胞TLR8的表达,这和我们在体外实验中发现的CL075与Poly dT合用诱导DC2.4细胞TLR8表达的实验结果相一致。 (3)我们采用RT-PCR和qRT-PCR检测了包括Hela细胞在内的十三种人类肿瘤细胞系,包括95D.HepG2.NICH446.U266.SGC.HCT-8. BGC.SW620.A549.HT1080.SKOV.3和U937等细胞TLR8的表达,结果发现,SKOV-3.U937和Hela表达高水平的TLR8mRNA,胃癌SGC,HCT8,BGC,SW620,A549和HT1080表达低水平TLR8;而在95D.HepG2.NICH446或U266细胞没有检测到TLR8mRNA.TLR8mRNA在宫颈癌细胞系中的表达水平显著高于其他细胞系,免疫荧光染色表明Hela细胞表达TLR8蛋白,而且TLR8分布于细胞浆内。用不同浓度的TLR8激动剂CL075处理HeLa细胞48小时后,流式细胞术检测发现G2/M+S期细胞的百分比增加,提示细胞增殖增加,这一结果被MTT法进一步证实。不同于顺铂,CL075没有诱导Hela细胞凋亡。CL075(1μg/ml)处理24小时后,Hela细胞中COX-2, BCL-2和VEGF mRNA水平显著增加并在48小时达到峰值。定量RT-PCR结果表明,与没有癌症患者的宫颈组织相比,宫颈癌患者组织样本中TLR7和TLR8的]mRNA水平增高。与此相反,TLR9在癌症患者和对照组组织样本中的表达没有明显差异,此外,Bcl-2和VEGF在宫颈癌患者的癌组织中的表达水平也显著增加。采用Spearman分析,我们发现宫颈癌样本中TLR8口Bcl-2或VEGF的表达水平之间存在正相关,而TLR7和Bcl-2或、/EGF mRNA表达水平的变化并无明显相关性。结论： (1)人TLR8激动剂CL075与TLR7/8调节剂Poly dT联合应用可以有效激活小鼠TLR8,而且小鼠TLR8活化以后产生与人TLR8相似的效应,如诱导髓系树突状细胞分泌TNF-α、IL-12,减少IL-10的分泌,有利于诱导Thl型免疫,增强DC的抗原提呈功能。因此,可以将[CL075+Poly dT]作为工具药,以小鼠为模型体内外研究TLR8的功能。 (2)TLR8可以作为肿瘤免疫治疗的重要靶点。在体外,TLR8激动剂诱导DC2.4分泌TNF-α和IL-12,增强DC2.4的抗原提呈功能,而且这些作用可能和DC2.4细胞TLR8的上调有关；在体内,TLR8激动剂促进荷瘤小鼠Th1型免疫应答炎性细胞因子(TNF-α和IL-12)的产生、减少包括IL-10, TGF-β和Foxp3的免疫抑制因子的分泌,刺激CD3+CD8-IFN-γ+T细胞和CD3+CD8+IFN-γ+T细胞的增殖,抑制CD4+CD25+Foxp3+T细胞的增殖,从而增强Lewis肺癌模型小鼠的抗肿瘤免疫应答,延缓肿瘤的发展进程,并且小剂量CL075+PolydT上调树突状细胞TLR8的表达以增强其对激动剂的反应。这些结果表明,TLR8的活化以及DC等免疫细胞TLR8的上调有利于增强抗肿瘤免疫应答。 (3)然而,不同的肿瘤以及发生于不同个体的同一种肿瘤具有明显的非均一性,因此TLR8及其激动剂的抗肿瘤作用需要全面评估,这在肿瘤的个体化治疗中具有十分重要的意义。人宫颈癌组织及宫颈癌细胞系高表达TLR8,这些肿瘤细胞也利用TLR8信号来创造有利于生长和生存的条件,如上调Bcl-2和VEGF表达。这表明TLR8信号在肿瘤治疗中可能是一把双刃剑。TLR8及其激动剂在不同类型的肿瘤中可能发挥不同的作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R730.51

【共引文献】