肥胖的交感神经激活机制与irisin的抗代谢紊乱和促脂解机制研究

发布时间：2018-01-27 08:38

  本文关键词： 高血压 肥胖 脂肪传入反射 交感神经活动 室旁核 Irisin 肥胖 代谢紊乱 脂肪组织 脂解效应 Irisin 肥胖 脂解效应 激素敏感性脂肪酶 3T3L1脂肪细胞　出处：《南京医科大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：肥胖以交感神经过度激活、胰岛素抵抗、糖和脂质代谢紊乱为特征,可引起高血压、糖尿病、代谢综合征等多种心脑血管和代谢性疾病。本研究主要探讨肥胖的交感神经激活机制和代谢紊乱机制,并进行了干预肥胖的实验性研究。实验在高脂饮食诱导的肥胖动物模型和3T3L1脂肪细胞进行,着重于探讨：①脂肪传入反射在肥胖性高血压交感神经激活中的作用及机制；②Irisin改善肥胖的代谢紊乱的作用与机制；③Irisin对脂解效应的影响与分子机制。第一部分：脂肪传入反射在肥胖性高血压交感神经激活中的作用与机制背景过度的交感神经激活状态在肥胖和肥胖性高血压的发病机制以及并发症的发生发展中起关键性作用。然而,肥胖性高血压的交感神经激活机制仍未阐明。我们近来发现在大鼠的白色脂肪组织(white adipose tissue, WAT)中注射辣椒素、缓激肽、腺苷或瘦素均能增强肾交感神经活动(renal sympathetic nerve activity, RSNA)和增加平均动脉压(mean arterial pressure, MAP)。我们将这种化学刺激WAT引起的交感神经激活称为脂肪传入反射(adipose afferent reflex, AAR)。WAT去神经支配或化学损毁下丘脑室旁核(paraventricular nucleus, PVN)均消除AAR, AAR是调节交感神经活动和血压的重要反射。神经解剖学研究表明WAT中有感觉神经末梢,并受交感传出神经支配。我们假设肥胖时增强的AAR可能在其交感神经激活和高血压的发生发展中起重要作用,本研究采用高脂饮食诱导的肥胖性高血压大鼠模型,探讨AAR对肥胖性高血压交感神经激活的作用及其调控机制。目的1.确定肥胖性高血压大鼠的AAR是否增强。2.探讨增强的AAR是否与肥胖性高血压大鼠的交感神经过度激活和血压升高有关。方法实验采用雄性SD大鼠(体重300-350g)按照1：3比例随机分为两组。一组给予对照饮食(Ctrl组,脂肪提供12%的热量,n=55),另一组给予高脂饮食(HFD组,脂肪提供42%的热量,n=165)。饲养12周后,HFD组根据体重分为肥胖抵抗组(obesity-resistant, OR组)和肥胖倾向组(obesity-prone, OP组)。前者为大鼠体重小于或等于对照组最高体重的大鼠,后者为体重大于对照组最高体重的大鼠。OP组大鼠又根据尾动脉收缩压(systolic blood pressure, SBP)再分为两组,SBP150mmHg的大鼠属于肥胖非高血压组(obesity non-hypertensive, ON组),SBP≥150mmHg的大鼠属于肥胖高血压组(obesity hyertensive, OH组)。12周末在麻醉的状态下进行急性实验,采用Powerlab生物信号采集系统记录RSNA、MAP和心率(heart rate, HR).以腹股沟WAT (inguinal WAT, iWAT)应用辣椒素引起的RSNA和MAP变化值作为评价AAR的指标。采用酶联免疫吸附测定法测定血浆去甲肾上腺素(norepinephrine, NE)、肾素和血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,Ang Ⅱ)水平,免疫组织化学的方法研究大鼠PVN中c-fos阳性神经元的分布。用立体定位技术和微量注射泵进行双侧PVN灌注。1.基础交感神经活动测定：Ctrl、OR、ON和OH大鼠的血浆NE水平和静脉快速注射六烃季铵引起MAP的最大变化值作为衡量基础交感神经活动的两个指标。2.AAR水平测定：Ctrl、OR、ON和OH大鼠iWAT应用辣椒素,观察RSNA、MAP和HR的变化。3.OH大鼠在iWAT应用辣椒素15 min后测定血浆NE、肾素和AngⅡ的水平。4. Ctrl、OR、ON和OH大鼠iWAT应用resiniferatoxin (RTX)阻断WAT感觉神经末梢活动,观察对基础的RSNA、MAP、HR和AAR的效应。5.OH大鼠rWAT和iWAT应用RTX阻断WAT感觉神经末梢活动后,测定5周内大鼠清醒状态下SBP的变化。6.WAT传入神经活动(WAT afferent nerve activity, WANA)的测定：Ctrl、OR、ON和OH大鼠切断WAT传入神经的中枢端后,在WAT传入神经的远端局部利多卡因,以应用利多卡因后WANA降低的最大值代表基础的WANA水平。7.OH大鼠腹膜后WAT (retroperitoneal WAT, rWAT)和iWAT注射瘦素拮抗剂LA,观察RSNA、MAP和HR的变化。8. Ctrl、OR、ON和OH大鼠WAT应用辣椒素后,观察PVN的c-fos的阳性神经元表达。9. Ctrl、OR、ON和OH大鼠PVN灌注利多卡因抑制PVN神经元活动，，观察对基础的RSNA、MAP、HR和AAR的效应。结果1.OH组基础交感神经活动显著高于其它三组,ON组高于Ctrl和OR组。2.Ctr1、OR、ON和OH大鼠在iWAT应用辣椒素后RSNA和MAP均显著升高。OH组AAR显著高于其他三组,ON组显著高于OR和Ctrl组。OR和Ctrl组无显著差异。3.AAR能显著升高OH组大鼠血浆肾素、Angll和NE水平。4. Ctrl、OR、ON和OH大鼠WAT应用RTX后引起迅速和短暂的RSNA和MAP升高效应,20 min后,RTX引起ON和OH大鼠持续的RSNA和MAP降低效应,Ctrl和OR大鼠则无显著变化。这种兴奋和抑制效应在OH组显著高于其他三组,ON组高于Ctrl和OR组。5.OH大鼠在双侧iWAT和rWAT注射RTX后能引起SBP至少3周的显著降低,4周后,SBP仍有降低趋势,但无统计学差异。6.OH组大鼠基础WANA显著高于其他三组,ON组高于OR和Ctrl组。7.OH大鼠在双侧iWAT和rWAT注射瘦素拮抗剂后能降低RSNA和MAP,在5 min达到最低并持续至少15 min。8. Ctrl和OH大鼠WAT应用辣椒素均能增加PVN中c-fos表达。OH大鼠在应用辣椒素后c-fos表达显著高于其他三组,ON组高于Ctrl和OR组。9.双侧PVN灌注利多卡因降低了OH和ON组的RSNA,并降低了OH组的MAP和HR。利多卡因对RSNA的效应在OH组比ON组更显著。PVN应用利多卡因后四组的AAR均被阻断。结论肥胖高血压大鼠AAR显著增强；增强的AAR,参与了肥胖性高血压的交感神经激活机制；PVN在肥胖时增强的AAR和交感神经激活机制中起重要的作用。第二部分FNDC5/irisin抗肥胖小鼠代谢紊乱的作用与机制背景肥胖症能引起一系列以能量代谢紊乱为特征的症候群,包括胰岛素抵抗、2型糖尿病、高脂血症等。尽管对肥胖的发生机制研究的越来越深入,肥胖仍缺乏有效的治疗策略。 Irisin发现于2012年,是可以促使小鼠的白色脂肪细胞发生棕色细胞样改变的一种肌肉因子。运动可刺激过氧化物酶体增殖受体γ辅激活因子α(PCG-1α)的表达,而PCG-1α可使III型纤连蛋白组件包含蛋白5(FNDC5)表达增多,FNDC5可蛋白水解并生成irisin,从而增加irisin水平。循环中irisin水平与人的上臂围、体重指数(body mass index, BMI)-血糖水平、脂肪因子ghrelin和IGF-1水平均呈正相关；而与年龄、胰岛素、胆固醇和脂联素水平,以及肥胖人群的肝内甘油三酯水平均呈负相关。代谢综合征患者血中irisin水平显著升高。然而,irisin水平持续升高对肥胖是否有改善作用仍然不清楚。本研究采用高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型,探讨FNDC5过表达和微量渗透泵皮下持续给予irisin对肥胖小鼠代谢紊乱的作用及机制。目的1.探讨FNDC5过表达对肥胖小鼠能量消耗和代谢紊乱的影响。2.探讨FNDC5过表达对肥胖小鼠脂解效应的影响及机制。3.探讨皮下持续给予irisin对肥胖小鼠代谢紊乱的影响。方法将6周龄雄性C57/BL6J小鼠随机分为两组,各24只,一组给予正常饮食(Ctrl组,脂肪提供12%的热量),另一组给予高脂饮食(HFD组,脂肪提供60%的热量)。6周后各组均随机分为两小组,分别尾静脉注射表达绿色荧光蛋白(Vector)和FNDC5的慢病毒后(Ctrl-Vector, Ctrl-FNDC5, HFD-Vector, HFD-FNDC5四组,各12只),继续饲养6周。另取12只6周龄小鼠给予高脂饮食,8周后随机分为两小组,分别植入皮下微量渗透泵给予saline和irisin (Saline和Irisin组,各6只),继续饲养4周。急性实验于给予饮食12周末进行。采用酶联免疫吸附测定法测定血清FNDC5、irisin、瘦素、胰岛素、甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸、去甲肾上腺素、血管紧张素II水平。实时定量PCR方法和Western Blot方法分别鉴定FNDC5、解偶联蛋白1(uncoupling protein 1, UCP1)和激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase, HSL)的mRNA和蛋白水平。1.FNDC5过表达的效应：(1) FNDC5过表达的鉴定：血清和组织中FNDC5和irisin的蛋白水平；(2)体重、总摄食量的变化；(3)小动物CT测定小鼠体内脂肪量;(4) PhenoMaster多通道代谢监测系统测定小鼠24h能量代谢指标：氧耗量、CO2生成量、产热量和机体活动量；(5)空腹血糖水平、葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量实验、血压；(6)血清瘦素、胰岛素、去甲肾上腺素、血管紧张素II、胆固醇、甘油三酯和游离脂肪酸的水平；(7)SAT和VAT中脂肪细胞的形态变化；(8)SAT和VAT中UCP1的mRNA和蛋白水平；(9)脂解效应：以禁食4 h和24 h后血清中游离脂肪酸水平评价;(10)SAT和VAT中HSL的mRNA水平以及HSL在丝氨酸563,565和660三个位点的磷酸化蛋白水平。2.肥胖小鼠皮下持续给予irisin的效应：(1)体重、摄食量的变化；(2)空腹血糖水平、葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量实验；(3)血清胆固醇、甘油三酯和游离脂肪酸的水平。结果1.肥胖小鼠的骨骼肌中FNDC5和irisin蛋白表达均高于Ctrl小鼠,心脏中表达有升高趋势,而肝脏、SAT和VAT的表达无显著差异；FNDC5过表达增加了血清、骨骼肌中FNDC5和irisin蛋白的水平。2.小鼠的FNDC5蛋白水平在骨骼肌中表达最高,心脏和肝脏中表达较高,在SAT和VAT中表达较低；irisin蛋白水平在骨骼肌中表达最高,心脏、SAT和VAT中表达较高,在肝脏中表达较低。3.FNDC5过表达对Ctrl和HFD小鼠的体重、摄食量和脂肪量均没有显著影响。4.FNDC5过表达增加了HFD小鼠的氧耗量、二氧化碳生成量和产热量,但对机体活动量无显著影响。5.葡萄糖和胰岛素耐量实验显示FNDC5过表达升高了HFD小鼠的胰岛素敏感性。HFD小鼠的空腹血糖和动脉收缩压降低,但Ctrl小鼠无显著变化。6. FNDC5过表达降低了HFD组血清去甲肾上腺素、胰岛素、胆固醇、甘油三酯和游离脂肪酸水平,但对血管紧张素II和瘦素的水平无显著影响。7.FNDC5过表达减小了HFD组SAT的脂肪细胞直径,但对VAT的脂肪细胞大小无显著影响。8.FNDC5过表达增加了Ctrl和HFD小鼠SAT中UCP1的mRNA和蛋白水平,对VAT中UCP1的mRNA和蛋白水平无显著影响。9.HFD小鼠禁食4 h和24 h刺激下的脂解效应均显著增强,Ctrl小鼠禁食24 h后脂解效应增强。10. Ctrl和HFD小鼠SAT和VAT中HSL的mRNA水平以及在丝氨酸563和660位点的磷酸化HSL均显著升高,而565位点磷酸化水平无明显变化。11. Irisin组体重和摄食量与Saline组无显著差异。12.葡萄糖和胰岛素耐量实验显示Irisin组胰岛素敏感性显著升高,同时空腹血糖水平降低。13. Irisin组血清中胆固醇、甘油三酯和游离脂肪酸水平显著降低。结论FNDC5/irisin增加高脂饮食诱导的肥胖小鼠的能量消耗、改善高脂血症、胰岛素抵抗和高胰岛素血症等代谢紊乱；FNDC5/irisin增强脂解效应,可能与cAMP/PKA介导的HSL磷酸化增强有关。Irisin有望成为代谢性疾病的有效治疗靶点。第三部分Irisin增强3T3L1脂肪细胞脂解效应的作用与机制背景脂肪组织的脂解效应是机体重要的生理过程,通过甘油三酯的动员,释放FFA和甘油到循环中,给机体提供能量。Irisin主要由III型纤连蛋白组件包含蛋白5 (FNDC5)蛋白水解生成,通过刺激白色脂肪细胞解偶联蛋白1(uncoupling protein 1, UCP1)的表达和棕色细胞样效应,对代谢产生有益作用。研究显示FNDC5/irisin不仅是肌肉因子,也是脂肪因子。我们的前期研究发现持续升高的irisin水平增加肥胖小鼠的能量消耗、抗代谢紊乱,同时增强脂解效应。本研究在体外水平探讨了irisin对3T3L1脂肪细胞脂解效应的影响及其下游信号机制。目的1.探讨irisin对3T3L1脂肪细胞脂解效应的影响。2.探讨irisin增强3T3L1脂肪细胞脂解效应的信号机制。方法脂解效应以3T3L1脂肪细胞培养基中的甘油和脂肪酸水平评价。Real timePCR和Western Blot方法分别鉴定激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase,HSL)的mRNA水平和蛋白水平。1. Irisin促脂解作用的时间效应：3T3L1细胞给予irisin 1000 ng分别处理30min、1 h、2 h和4 h后,观察irisin在基础状态下和异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)刺激下脂解效应的变化。2. Irisin促脂解作用的剂量效应：3T3L1细胞分别给予0、10、100和1000ng的irisin处理1h后,观察irisin在基础状态下和ISO刺激下脂解效应的变化。3.3T3L1脂肪细胞给予腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536或PKA抑制剂H-89预处理12 h后,给予irisin 1000 ng处理1 h,观察SQ22536和H-89对irisin脂解效应的影响。4.3T3L1脂肪细胞给予irisin 1000ng处理1 h后,测定细胞的cAMP水平和HSL的mRNA水平。5.3T3L1脂肪细胞给予irisin处理后,观察基础状态下细胞中HSL在丝氨酸563,565和660三个位点的磷酸化蛋白水平。结果1. Irisin对3T3L1脂肪细胞基础状态下的脂解效应在1h达到最强,4h后仍有增强趋势；ISO刺激下的脂解效应不随irisin处理时间的改变而显著变化。2. Irisin剂量性增加3T3L1脂肪细胞在基础状态下的脂解效应；而ISO刺激的脂解效应并不随irisin剂量的增大而增强。3.SQ22536和H-89预处理阻断了irisin对3T3L1脂肪细胞的促脂解效应。4. Irisin处理后,3T3L1脂肪细胞的cAMP水平、HSL的mRNA水平均显著升局。5. Irisin处理后,3T3L1脂肪细胞基础状态HSL磷酸化蛋白在丝氨酸563和660位点表达均显著升高,而565位点无显著变化。结论Irisin增强3T3L1脂肪细胞基础状态下的脂解效应,但对ISO刺激的脂解效应无显著影响。Irisin增强脂解效应与cAMP/PKA介导的丝氨酸563和660位点的磷酸化HSL增强有关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R589.2


本文编号：1468081